课题3　血红蛋白的提取和分离

1、课题3 血红蛋白的提取和分离,一、课题的目标：通过尝试对血液中血红蛋白的 提取和分离，理解色谱法、电泳法 二、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 三、课题难点：样品的预处理、色谱柱填料的处理 和色谱柱的装填,血液组成成分,阅读思考： 血液由_和_两部分组成。 血细胞中_细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_。 该化合物是由 _和_构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的_基团。,红细胞,血红蛋白,2条-肽链,2条-肽链,亚铁血红素,课本P66,本实验理想的材料是什么？原因是？,答：哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,蛋白质的提取和分离一般

2、步骤：,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,一、样品处理及粗分离,1.洗 涤 红 细 胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？ 洗涤的方法是什么？ 洗涤干净的标志是什么？,血液 100mL,红细胞,血浆,红细胞,重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,采集血样,分离红细胞,洗涤红细胞,操作提示：,P69,2.释放血红蛋白,阅读思考： 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了 哪些物质，有什么作用？,目的分析： 蒸馏水的作用是_。 加入甲苯的作用是_。 充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,3.分离血红蛋白溶液,红细胞 混合液,分液漏斗中静置,有机溶剂 血红蛋白,4层,有

3、机溶剂：无色透明，甲苯层 脂类物质：白色 血红蛋白：红色透明 红细胞破碎物沉淀：暗红色沉淀,分层不明显原因是？,可能是洗涤次数少，未能除去血浆蛋白。,4.透析血红蛋白,透析的目的是什么？,去除血红蛋白中的小分子杂质,透析的原理是什么？,半透膜的选择透过性,磷酸缓冲液的作用是什么？,维持血浆蛋白的特性。,300ml,有利于杂质分子充分的向外扩散,（粗分离）,二、纯化及纯度鉴定,由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。 如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等,缓冲溶液洗脱剂 （1）作用： （2）配制：,抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持 pH稳定。,（3）在血红蛋白的提取和分离实验中

4、用的缓冲液的原因？,目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境， 保证血红蛋白的正常结构和功能。,（一）纯化： 1、蛋白质分离原理,蛋白质各种特性的差异： 1）分子的形状、大小 2）所带电荷性质和多少 3）溶解度 4）吸附性质 5）对其他分子亲和力 等等,（一）纯化： 2、蛋白质分离的方法,（1）凝胶色谱法：又称分配色谱法,（2）凝胶电泳法：,凝胶色谱法,1.凝胶色谱柱的制作：,2.凝胶色谱柱的装填：,教材图519,3.样品的加入和洗脱,操作提示：P69,1.调液面,2.加样,4.洗脱,5.收集,注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象， 否则重新填装。,3.再调液面,1.调液面,2.加

5、样,3.再调液面,4.洗脱 、 5.收集,图5-13,操作提示：P70,（一）纯化： 3、蛋白质分离的原理,（1）凝胶色谱法：又称分配色谱法,原理,根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法,凝胶,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道）,相对分子质量小的：进入凝胶内部通道；长；慢,相对分子质量大的：在凝胶外部移动；短；快,P65图5-13,操作提示：P70,（2）凝胶电泳法：,原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分

6、子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程,常用电泳方法 琼脂糖凝胶电泳 聚丙酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。 SDS 带负电荷多的 ，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。,（二）纯度鉴定,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,注意事项,1. 红细胞的洗涤： 洗涤次数不能过少；低速、短时离心。 2. 凝胶的预处理： 沸水浴法，还能除去微生物和气泡 3.色谱柱的装填： 装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。 4. 色谱柱

7、成功标志： 红色区带均匀一致地移动。,知识总结,血红蛋白的提取和分离,蛋白质的 提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度鉴定,血液组成成分,1、样品 处理,3、纯化,4、纯度鉴定,2、粗分离,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,凝胶色谱法进行纯化,1. 蛋白质提取、分离在分子生物学研究中具有重要意义。 （1）蛋白质提取和分离的步骤一般分为_。 （2）提取血红蛋白时，选用猪血，而不选用鸡血。理由是_。 （3）实验前采取新鲜的猪血，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，目的是_。若要从红细胞中提取血红蛋白，则要对获得的红细胞进行_、_和分离血红蛋白溶液、透析，才能获得含杂质较少的血红蛋白溶液。 （4）通过_法将样品进一步纯化，经_方法进行纯度鉴定。 （5）在凝胶色谱法制作过程中，所用凝胶的化学本质大多为_。装填凝胶柱时，不得有气泡存在，原因是_。 （6）血红蛋白是一种含铁的蛋白质，它存在于_中。若要根据某人血红蛋白的含量数据来判断其健康状况，则体检时_（选填“要”或“不要”）空腹做_。若某人患有慢性贫血，则体检单上会显示血红蛋白含量_。 （7）科学家发现家蝇体内存在一种抗菌活性蛋白，这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者重视。分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的_、大小及形状不同，在电场中的_不同而实