植物组织培养技术ppt课件

1、1.实验室设置和设备2。实验3的基本操作。培养基的组成和制备。培养条件的选择、植物细胞工程实验室和基本操作。1.实验室设施和设备是组织培养研究的主要场所，应能满足许多任务，如清洁、培养基制备、储存、无菌操作、培养和鉴定。2，1基础实验室，1.1洗涤室的大小根据工作量确定，一般面积控制在30-50m2。实验室的一侧有一个特殊的清洗槽用来清洗玻璃器皿。中央测试台还应配备两个水箱，用于清洁小玻璃器皿。如果工作量很大，你可以买一台洗瓶机。准备1-2个清洗槽，专门用于清洗对清洁度要求高的玻璃器皿。此外，还有落水架、干燥箱、橱柜、超声波清洗机等。应提供。地面应该防潮，排水良好。3，4，面积约60平方米。主

2、要仪器设备有：冰箱、天平、微波炉、酸度计、培养基分装装置、医药箱、仪器柜、气泵、电炉、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶、储物瓶等。冰箱的容积应为180-200升，用于储存培养基母液、激素和维生素等珍贵药物、彩膜和保存植物材料。平衡应该有不同的敏感度。1.2、培养基制备室5和6，配备试验台、高压釜、排气和灭火设备、细菌过滤设备、干热消毒柜、电炉等。灭菌锅的选择应基于不同的要求。小型医用便携式高压灭菌器可用于普通实验室，带自动压力和温度控制的立式高压灭菌器可用于大型实验室。大型卧式消毒器可用于生产实验室。如无条件，上述车间可合并为一个准备室，要求是设备安装和布置合理，房间宽敞、

3、明亮、通风，地面易于清洁和防滑。1.3消毒室7、8、无菌操作室主要用于实验材料的接种，故又称接种室。它通常由内外两个房间组成，外面的缓冲室用于准备和防止污染。缓冲室的门应与接种室的门错开，两扇门不应同时打开，以保证无菌室不会因开门和人员进出而带入杂菌。缓冲室应配备水箱、试验台、鞋帽架、橱柜和紫外线灯。无菌手术室的内壁应用塑料钢板或瓷砖装饰。工人进入手术室前应穿消毒工作服和拖鞋。室内应配备洁净工作台、紫外线灯、解剖器、各种接种仪器等。1.4、无菌操作室，9、10。为了控制培养室的温度、光照时间和强度，培养室的室内没有窗户，但应留有通风窗，并安装排气扇。室内温度由空调控制，照明由荧光灯控制。天花板

4、和内墙应采用塑料钢板装饰，地面应铺水磨石或瓷砖。一般来说，应该分为两个房间，一个是光文化室，另一个是暗文化室。训练室外应有准备室或走廊。培养室应配备培养架、旋转床、摇床、光照培养箱、生化培养箱、自动时间控制器等。荧光灯一般为40W，固定在培养架的侧面或架子下面。每层楼有两个荧光灯，距离为20厘米，光强度为2000-3000升。1.5培养室，11、12、13、2辅助实验室，2.1鉴定室细胞学鉴定室其功能是从细胞学上鉴定和研究培养材料。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受湿气和灰尘的污染。应配备各种显微镜和照相系统。实验室中的生化分析室，其主要目的是培养，2.2，温室，16，(1)洗涤液的制备

5、，2基础实验操作，1。清洗技术，17 . a .新购买的玻璃仪器表面经常附着游离碱性物质，可先用0.5的洗涤剂清洗，然后用自来水清洗，然后在12的盐酸溶液中浸泡一夜(不少于4小时)，然后用自来水清洗，最后用去离子水清洗两次，(2)清洗方法，18，首先用自来水清洗，直到没有污垢，然后用合适的刷子蘸洗涤剂(粉末)清洗， 或者浸泡在0.5的清洁剂中进行超声波清洗(试管不得进行超声波清洗)，然后用自来水彻底清洗清洁剂，用无离子水清洗两次，并干燥以备后用(测量仪器不能干燥)。 清洗后，不得有水滴挂在容器内或容器外，否则，如果大量清洗后仍有水滴挂在容器上，应将其浸泡在洗液中数小时(或用洗涤剂擦洗)，然后再

6、次清洗。旧玻璃仪器的清洗聚乙烯和聚丙烯塑料器皿在生物化学实验中越来越多地被使用。首次使用塑料器皿时，可用8毫升/升尿素(用浓盐酸调至酸碱度=1)清洗，然后依次用去离子水、1摩尔/升氢氧化钾和去离子水清洗，再用103摩尔/升乙二胺四乙酸去除金属离子污染，最后用去离子水彻底清洗。每次使用后，只能用0.5倍的清洁剂清洗，然后用自来水和去离子水清洗。塑料器皿的清洁。金属制品不应用各种洗涤液清洗(新的可以用热洗衣粉水清洗)。当需要清洁时，通常用酒精擦洗，然后用火焰烘干。e .灭菌过滤器用清水冲洗后，用洗液冲洗，再用清水冲洗，最后用蒸馏水冲洗，干燥备用。金属制品洗涤，21，(1)，杀菌是极其重要的。首先，

7、应该建立细菌和无菌的概念。细菌的种类：细菌：所有暴露在空气中的物体至少表面上都有细菌。如植物表面、洁净工作台台面、未经处理的工具和手等。无菌：高压和高温处理(工具、器具、培养基等)。物理或化学处理；用火烘烤的物体；不与内外表面接触的健康动植物组织可能是无菌的(有时有内生菌，但它们不会影响培养或污染)。2.绝育，22，1。物理方法：干热、湿热、过滤(0.25微米)紫外线灯、超声波等。2.化学方法：使用消毒剂或抗生素，如酒精、次氯酸钠、氯化汞、漂白粉、高锰酸钾、过氧化氢、福尔马林等。(2)灭菌方法，23。干热灭菌玻璃器皿、仪器用湿热灭菌介质、蒸馏水、仪器、卫生棉条等。熏蒸灭菌接种室、培养室、过滤灭

8、菌液体培养基、蒸馏水灭菌培养料烧灭菌器具和瓶口。培养室，各种灭菌方法及其适用范围，24，适用于玻璃器皿和金属器具的灭菌。操作方法：150、40分钟或120、120分钟，如果发现有芽孢杆菌，160、90、120分钟，(1)干热灭菌，25分钟，适用于各种器皿、培养基、器皿、蒸馏水、棉条、纸等。121保持2030分钟。注意：只有加入足够的水，气压降至0时，才能打开盖子。(2)湿热灭菌，26。培养基的灭菌通常在高压和高温下进行，但是如果培养基中的一些成分在高温下分解(例如一些生长调节剂GA3、玉米素等)。)，需要过滤灭菌。此外，酶、血清等。也需要通过过滤进行消毒。将生长调节剂或酶制备到一定浓度，用注射

9、器注入微孔滤膜。滤膜的孔径为0.220.45微米。制备培养基时，在高压下对培养基进行灭菌。当降至50左右时，加入适量的激素，然后分开包装。(3)过滤灭菌，27、主要采用紫外线灯照射，适用于实验室空气、手术台等。灭菌时间2030分钟。注意：关灯，5分钟后再次进入。在清洁工作台上关灯后，打开风扇。(4)辐射灭菌，28，燃烧wit几种常用消毒剂的效果比较：(6)消毒剂；(30)熏蒸应在长期不用的培养室或接种室进行。方法：甲醛和高锰酸钾熏蒸。甲醛的量通常计算为每立方米空间2-6毫升，高锰酸钾的量是甲醛的一半。房间准备好之后，将称量好的高锰酸钾放入瓷碗或烧杯中(最好在碗或杯下放一张报纸进行清洗)，然后将

10、甲醛倒入碗或杯中，并立即离开房间并关上门。几秒钟后，甲醛溶液沸腾并挥发。高锰酸钾是氧化剂。当它与一部分甲醛反应时，氧化反应产生的热量会将剩余的甲醛挥发成气体。熏蒸消毒，31。甲醛熏蒸接种室应在使用前至少24小时进行，并在熏蒸后保持封闭4小时以上方可进入室内工作。甲醛对人的眼睛和鼻子有很强的刺激作用。因此，它可以在使用前用氨中和。取相当于甲醛的氨水，倒入另一个烧杯中，迅速放入熏蒸室，使甲醛和氨水发生中和反应，消除甲醛气味，减少对人体的刺激。氨的使用应在工作前2小时进行。有原料的培养室也可以用乙二醇加热熏蒸。32.人为因素(工人本身):工作服、帽子、口罩、用酒精搓手。物品因素，器皿及器具，培养皿：

11、清洗热压玻璃器皿：清洗干热(干热箱)或干燥接种器具：用四氯化碳布擦拭湿布，浸泡在75%酒精中灼烧，培养基：湿热，培养料，外生菌：用水清洗内生菌，在茎尖培养中加入抗生素：青霉素和利福平，操作空气：用95%酒精擦洗地板和擦干净工作台。3.无菌操作技术。1.实验设备和材料的准备。用75%的酒精擦拭干净，然后在室内用紫外线灯消毒20-30分钟。注意：不要将太多物品放在桌面上或重叠放置，以免降低杀菌效果。3.关闭紫外线灯，打开风扇，5-10分钟后进入缓冲室，用75%的水洗手和洗手，并更换无菌衣服、帽子和口罩。进入接种室。(注意：除非有特殊情况，否则不要离开工作台。)34。4.用7075酒精擦拭工作台，并

12、消毒双手。测试设备也应该用酒精消毒。点燃酒精灯，用火焰点燃金属乐器，冷却后备用。注意：所有操作应在火焰附近和燃烧后进行。金属仪器不应过度燃烧，以免退火。移液管不能燃烧，也不能用太长时间在火焰上培养瓶口、塑料材料和橡胶材料。35，5。取用流动水清洗过的外植体(至少30分钟)，用一定的消毒剂浸泡，用无菌水清洗34次，放入无菌培养皿中，置于酒精灯的火焰下，用无菌接种设备进行分离、切割或其他处理。36，6。打开培养瓶，在灯焰下旋转烧瓶口，用镊子将培养料放在培养基上，将烧好的镊子放回原处，烧瓶口，盖上瓶塞。7.用酒精擦洗工作台和手。进行下一轮操作。注(1)训练时，动作要准确、敏捷，但不能太快，以免气流受

13、阻，增加污染的机会。(2)不能用手触摸已消毒的器具，如果已经接触过，用火焰燃烧消毒或更换备件。(3)为方便起见，台面上的物品应布局合理。原则上，右手使用的物品应放在右边，左手使用的物品放在左边，酒精灯放在中间。(4)自始至终保持一定的顺序，在治疗前不要将组织或细胞过早暴露在空气中。同样，使用培养液前不要过早开瓶；如果使用后不重复使用，应立即关闭瓶口，站直，这样会增加细菌掉落的机会。38，(5)当吸收营养液、细胞悬液和其他种类的液体时，吸管应分开使用，且不应混合(7)手或相对脏的物品不能越过敞开的瓶口，这是最容易污染的。如果在添加液体时吸管的尖端接触到瓶口，应该扔掉吸管。39、接种时，打开火焰附

14、近的瓶口，使瓶体倾斜，以防止空气中的微生物落入瓶中。40、整个接种操作应在火焰附近进行，且动作应迅速正确。41、接种过程中应尽可能达到暂停要求，以防止操作造成污染。42、不要用手触摸瓶盖内壁或瓶口。接种后立即盖上瓶盖，盖好瓶口，这是对是错。44.接种一瓶燃烧的器具以防止交叉污染。45.种子和分生组织：它们通常附着在培养基的表面，而不是插入培养基中，以避免氧气供应不足，这是对还是错。46.接种茎段：注意将形态学下端插入培养基，同时将形态学上端暴露在空气中，这是对还是错。第二，植物生长在温室控制的环境中；第三，在无菌环境下进行体外培养的植物。4.外植体的选择和处理技术；48.1.首先，选择优良基因

15、型检测的目的应该明确。例如，蔬菜和作物的脱毒快繁是为了去除病毒，提高产量和质量，因此应选择当地栽培确认的高产优质品种作为脱毒材料，品种必须可靠。还应选择有价值的植物用于花卉和观赏植物的快速繁殖。2.材料取自生机勃勃、健壮且无病虫害的植物。母柱代谢旺盛时期获得的外植体再生能力强，实验容易成功。(1)外植体的选择，49。3.外植体的选择因外植体而异。如果采用茎尖培养，茎尖的大小对脱毒有明显的影响。另一个例子是未成熟胚胎培养，胚胎年龄也非常重要。(稍后具体说明)4 .外植体在选择过程中的生长动态往往与物种的生长规律(生物钟)有关。因此，最好在最适合植物生长的时间取材栽培。会得到更好的结果。对选择的母

16、株进行预处理和人工管理，可以促进母株的旺盛生长和活跃代谢，从它们身上培养很容易成功。2.外植体休眠的处理植物的一些种子、未成熟胚或芽处于休眠状态。为了打破休眠，可以使用低温处理或化学物质如赤霉素。由于植物不同，处理温度和时间也不同。(2)外植体的处理，51，3)组织内生菌的处理(1)添加抗生素，注意抗生素的用量，高浓度的抗生素容易导致培养物死亡(2)以生长期的旺盛生长点为外植体进行初始培养。(3)被内生菌污染的培养物的茎尖被连续转移。(1)用无机营养物培养的植物组织、器官、细胞或原生质体需要不断地补充一些无机化学物质。除了碳、氢和氧，需要更多的元素被称为常量元素，而需要较少的元素被称为微量元素。53，培养基中大量元素的使用量一般为每升几十到几千毫克。主要元素包括氮、磷、钾、钙、镁和硫.培养基中添加量最多的是氮，其通常由硝酸盐或铵盐或两种盐的组合提供。常量元素和微量元素的含量一般不超过每升几十毫克。植物所需的微量元素包括铁、铜、锌、硼、钼、锰和钴。其他化学物质通常含有微量元素杂质。因此，应注意微量元素的过度使用，这将导致生长抑制等毒性现象。有机化合物包括维生素、氨基酸、糖类和一些其他有机添加剂。维生素维生素在酶系统中有催化作用。硫胺素(VB1)与愈伤组织的形成和生存能力有关，可能是所有植物在组织培养的初始阶段所需的维生素，而盐酸吡哆醇(VB6)促进根的生长，烟酸(