第7章酶工程制药

1、第七章 酶工程制药,第一节 概 述,一、酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化功能的一类蛋白质。其特点： 催化效率高 专一性强 反应条件温和 催化活性受到调节和控制,二、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗透结合发展而形成一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。,第二节 酶的来源和生产,一、酶的来源 早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。工业生产一般都以微生物为主要来源。,目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。其特点是： A、微生物种类繁多，凡是动植物体内存在的酶，几乎都年从

2、微生物中得到； B、微生物繁殖快、生产周期短、培养简便，并可通过控制培养条件来提高酶的产量； C、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异的手段，能培育出新的高产菌珠。,二、酶的生产菌 对菌种的要求 a、产酶量高，酶的性质符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌； b、不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生毒素； c、稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体； d、能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。,生产菌的来源 a、菌种保藏机构和有关研究部门获得； b、大量要从自然界中分离筛选；自然界是产酶菌种的主要来源，土壤、深海、温泉、火山、森林等都是菌种采集地。 筛选产酶菌的方法：采集、菌种的分

3、离初筛、纯化、复筛和生产性能检定等。 菌种改良的途径：应用遗传学原理进行基因突变、基因转移和基因克隆。,目前常用的产酶微生物 A、E.coli ：是应用最广泛的产酶菌。分泌胞内酶，经细胞破碎分离得到。在工业上用于生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。 B、枯草杆菌：主要用于生产-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。 C、啤酒酵母：用于酿造啤酒、酒精、饮料、面包等。 D、曲酶（黑曲酶和黄曲酶）：主要生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶。 E、其他产酶菌：青霉菌、木霉菌、根霉菌、链霉菌等。,第三节 酶和细胞固定化,一、固定化酶的制备 固定化酶

4、的定义： 固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。,固定化酶的特点 具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。 可多次使用 反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。 反应条件易控制。 酶的利用效率高。 比水溶性酶更适合于多酶反应。,酶和细胞固定化方法 酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）,酶和细胞固定化模式,载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。 A、物理吸附法：用物理方法将酶吸附于

5、不溶性载体上的固定化方法。 优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生 缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。,B、离子结合法：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。 优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。 缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或pH的影响，离子强度高时，酶易脱落。,C、共价结合法：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。 优点：酶与载体结

6、合牢固，稳定性好，不易脱落。 缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应。,（2）交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺-2、2-二磺酸、1,5-二氟-2,4-二硝基苯。,（3）包埋法： A、网格型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。常用合成高分子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞。,B、微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微

7、米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本也高。 （4）选择性热变性法：将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。此法专用于细胞固定化。,4、酶和细胞的固定化载体 （1）吸附载体：无机物和有机物，见表6-1 （2）包埋载体：卡拉胶、海藻胶 （3）共价结合载体：纤维素、Sephadex A200、琼脂、琼脂糖、苯胺多孔玻璃。,载体应具备的条件： （1）固定化过程中不引起酶变性； （2）对酸碱有一定的耐受性； （3）有一定的机械强度； （4）有一定的亲水性和稳定性； （5）有一定的疏松网状结构，颗粒均匀； （6）共价结

8、合时有可活化基团； （7）有耐受酶和微生物细胞的能力； （8）廉价易得。,5、固定化酶的制备技术 （1）吸附法制备技术：将酶的水熔液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶即得固定化酶。 （2）包埋法制备技术： 凝胶包埋：先将凝胶材料与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点以下的温度，然后假如预保稳的酶液，混合均匀，最后冷却凝固成型和破碎即成固定化酶。,微囊化包埋：将酶定位于具有半透膜的微小囊内。半透膜厚约20nm，膜孔径40 nm .其表面积与体积比很大，包埋酶量也多。,（3）交联法制备技术：向酶液中加入多功能试剂，在一定的条件下使酶分子内或酶分子间彼此连接成网格人结构而形成固定

9、化酶。反应速度与酶的浓度、试剂的浓度、pH、离子强度、温度和反应时间有关。 如：0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛在pH5.27.2，0C，24h即完成反应。,二、固定化细胞的制备 固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。 被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。,固定化细胞的特点 有细胞特性，生物催化剂功能，固相催化剂特点。 优点： 无须进行酶的分离纯化 保持酶的原始状态，酶回收率高 比固定化酶稳定性高 细胞内酶附助因子可再生 细胞本身含多酶体系 抗污染能力强,固定化细胞的制备技术 载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的载体 相结合的固定化方法

10、。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性 缺点：吸附容量小结合强度低。,包埋法 将细胞定位于凝胶网格内的技术。 交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固定化方法。由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。 无载体法 靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。,三、固定化方法与载体的选择依据 固定化方法的选择 固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。 固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用

11、，在经济上有极强的竞争力。 固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。,载体的选择 为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。,四、固定化酶的形状与性质 固定化酶的形状 颗粒状：包括酶铢、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶铢。 纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于

12、填充床反应器。,膜状：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。 管状：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。,固定化酶的性质 酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。,

13、酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。 操作稳定性 贮藏稳定性 热稳定性 对蛋白酶的稳定性,酶学特性的变化 底物专一性：对底物的专一性下降。 最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。 最适温度一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。 米氏常数(Km) ： Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。 最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。,五、固定化细胞的性质 细胞固定化主要利用

14、胞内酶，固定化的细胞主要用于催化小分子底物的反应，不适于大分子底物。 1、 pH：变化无特点规律 2、最适温度：通常与游离细胞相同 3、稳定性：一般比游离细胞高,六、固定化酶活力的测定方法 酶活力:在单位时间内单位体积中的底物减少量或产物增加量来表示。 分批测定法 连续测定法,第四节 固定化酶和固定化细胞的反应器,一、反应器的类型和特点 间歇式搅拌罐反应器 用于游离酶反应后随即放料。 连续流动搅拌罐反应器 连续进料、连续出料,填充床反应器 固定化酶添充于床层内。反应器内的流体的流动形态为平推流形。 底物以恒定流速通过反应床。 流化床反应器 底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于

15、流化状态，达到混合的目的。,循环反应器 部分反应液流出和新加入底物流入液混合，再进入反应床进行循环。 连续流动搅拌罐-超滤膜反应器 连续流动搅拌罐的出口装有超滤膜，只允许产物和未反应的底物通过，酶被截留，可反复使用。 其它反应器 转盘式、筛板式等,各种反应器的示意图,a 间歇式搅拌罐反应器 b 连续流动搅拌罐反应器 c 连续流动搅拌罐-超滤膜反应器 d 填充床反应器 e 循环反应器 f 流化床反应器,二、反应器的选择依据 根据固定化酶的形状来选择 根据底物的物理性质来选择 根据反应的动力学特性来选择 根据外界环境对酶的稳定性的影响来选择 根据操作要求及反应器费用来选择,第五节 酶工程在医药工业

16、中的应用,酶促反应的专一性强,反应条件温和。酶工程优点：工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度好。,一、酶在医药领域的应用,1、在疾病诊断方面的应用 （1）根据体内原有酶活力的变化来诊断某种疾病 利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎 （2）用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病 利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病,2、在疾病治疗方面的应用 （1）蛋白酶，主要用于治疗消化不良和食欲不振 （2）溶菌酶，具有抗菌、消炎、镇痛等作用 （3）超氧化物歧化酶，具有抗辐射作用 （4）L-天冬酰胺酶，用于治疗白血病 （5）淀粉酶，消化药。,（6）乳糖酶，治疗乳糖缺乏症，有些人或婴儿肠道中缺乏

17、乳糖酶，饮用含有乳糖的牛奶等食品时，由于不能分解乳糖，在肠道中，乳糖会因为细菌分解而产生有机酸，刺激肠道引起呕吐。 （7）脂肪酶，消化剂。假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于预防和治疗高血脂病,（8）右旋糖苷酶，水解右旋糖苷生产小分子产物，对龋齿有显著的预防作用，可加到牙膏和淑口水中。 （9）链激酶，可催化纤维蛋白酶原，激活成纤维蛋白酶，将纤维蛋白水解，使血栓溶解。 （10）尿激酶，具有溶血栓的活性,3、在药物生产方面的应用 利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素 4、在分析检测方面的应用,二、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸 1.技术路线 E.Coli 斜面 细胞

18、固定化细胞 青霉素G 转化液 滤液 6-APA 粗品,培养,固定,转化,过滤,抽提,（1）大肠杆菌的培养 （2）大肠杆菌固定化 （3）固定化大肠杆菌反应堆制备 （4）转化反应 （5）6-氨基青霉烷酸的提取,（1）大肠杆菌的培养 斜面培养基为普通肉汤琼脂培养基，发酵培养基的成分为蛋白胨、氯化钠、苯乙酸、自来水。用氢氧化钠调pH7.0，高压灭菌30min后备用。在250ml摇瓶中加入发酵液培养液30ml，将斜面接种后培养18-30h的大肠杆菌D816（产青霉素酰化酶），用15ml无菌水制成菌细胞悬液，取1ml悬浮液接种至装有30ml发酵液培养基的摇瓶中，在摇床上28，170r/min振荡培养15h，如此依次扩大培养，直至1000-2000L规模通气搅拌培养，培养结束后用高速管式离心机收集菌体，备用。,（2）大肠杆菌固定化 取湿菌体100kg，置于40 反应罐中，在搅拌下加入50L 10%明胶溶液，搅拌均匀后加入25%戊二醛5L，再转移至搪瓷盘中，使之成为3-5cm厚的液层，室温放