病毒学研究的基本方法

1、第三节病毒学研究的基本方法有：内容一、理化要素对细小病毒的作用二、标本采集和处理三、病毒检测分离培养四、细小病毒鉴定五、细小病毒定量的几个概念；一、理化要素对细小病毒的作用理化要素包含热、辐射、pH和化学试剂等对细小病毒失活作用或细小病毒蛋白包衣和脂质等结构但灭活的细小病毒可持续保持抗原性，诱导干扰素的产生。 了解各种理化因素对细小病毒失活作用具有重要的实际意义。 由于不同细小病毒对不同理化因子的易感性不同，消毒时必须选择对其细小病毒特征最有效的消毒剂。 相反，在保存毒种和细小病毒材料时，必须注意防止和回避各种失活条件。 不同细小病毒对理化因素的抵抗力也是鉴定细小病毒的重要依据。 (1)温度细

2、小病毒怕热。 大多数细小病毒在4以下可以良好地生存，特别是在干冰温度(-70 )和液氮(-196 )下能够更长期地维持感染性。 相反，大多数细小病毒可在5560的条件下在几分钟到十几分钟内禁用，而100可在几秒内禁用。 因此，必须在低温下保存细小病毒和疫苗等。 不同细小病毒对热量的抵抗力不同，也有明显差异。 例如，具有粘细小病毒和RNA肿瘤细小病毒等被膜的细小病毒，在感染半寿期为37 1h天花细小病毒干燥的状态下，可忍耐由100加热510min的热量引起的细小病毒的失活作用，受到周围的环境要素的影响。 蛋白质、钙元素、镁等络离子的存在，往往可以提高一些细小病毒对热量的抵抗力。 长期保存细小病毒

3、一般采用以下两种方法：1.快速低温冷冻细小病毒液中加入失活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，再加入510个二甲基亚砜，快速冷冻和保存-70-196。 含细小病毒的组织材料可以直接低温冷冻保存，如有些细小病毒可以先浸泡在50的甘油缓冲盐水中再低温保存，效果更好。 2 .冷冻干燥可在真空条件下使冷冻细小病毒混悬剂脱水(通常为冷冻真空干燥)，从三年五载保存数十年，毒性不变。 毒种保护剂：脱脂牛奶、灭活动物血清、饱和蔗糖溶液等。 真空干燥时，加入等量的保护剂，每根加入0.20.5ml细小病毒液，放入冻干机内冻结。 现代冻干机具备冷冻、干燥、抽真空等所有装置，使用方便。 (2)ph值的多数细小病毒在pH6

4、8的范围内稳定。 在pH5.0以下的酸性环境、以及pH9.0以上的碱性环境中，细小病毒大多迅速失活。 酸、碱溶液是病毒学实践中常用的消毒剂。 储藏细小病毒优选中性或微盐化学基性，例如将细小病毒病材料放入中性的50甘油盐水中保存。 但是，必须指出，各种细小病毒对pH变化的稳定性有可能显着不同。 例如，肠孤细小病毒能抵抗pH 3.0的口蹄疫病毒在pH 6.06.5和pH 8.09.0下迅速失活。 猪水疱症细小病毒在pH2.2条件下24h内维持感染性。 因此，pH值的稳定性是鉴定某些细小病毒的重要指标。 (3)放射性射线电离放射性射线中的放射性射线和x射线以及非电离放射性射线紫外辐射对细小病毒显示出

5、失活作用。 这是因为破坏了细小病毒核酸的分子构造，失去了生物活性。 (4)医学超声和光动力作用医学超声主要通过强烈的振动对细菌、其他微生物和细胞球等表现出破坏作用，但细小病毒的失活作用不明显。 普通的医学超声破坏细胞球，从细胞球内释放病毒粒子，收集并纯化细小病毒。 在细小病毒核酸中，有甲苯胺蓝和氮丙啶橙等染料起作用的话，会被可见光失活的，被称作染料的光动力作用。 (5)脂溶剂二乙醚、氯元素仿、丙酮等脂溶剂对具有被膜的细小病毒有失活作用。 乙醚等灭活试验是鉴定细小病毒的重要指标。(6)甘油和抗生素应用了50种甘油盐水，细小病毒几天甚至可以三年五载存活。 生产实践中以50甘油盐水储存细小病毒材料，

6、对云同步采取冷藏措施是有效的普通抗生素对细小病毒无效，放入含细小病毒材料杀菌，往往有利于病毒检测分离和培养。 近年来人们发现一些抗生素对细小病毒起作用，一些已用于细小病毒病的防治，如金刚烷铵、利福平、放线菌素d等。 二、用于分离标本采集和处理细小病毒的标本应包括一盏茶量的活细小病毒，必须根据细小病毒生物科学特性、细小病毒感染特征、流行病学规律及机体免疫保护反应历程，选择必要的标本种类，确定最合适的采集时间和标本处理方法。 标本采集需要无菌操作，如有细菌污染，可采用添加抗生素、过滤、离心分离等方法处理。 由于多数细小病毒对热不稳定，标本经处理后必须立即接种。 需要运输或保存时，可在数小时内装入5

7、0中性甘油内4中保存，需要长时间冻结保存的标本最好保存在-20以下或干冰中。 以采集感染了细小病毒的动物疾病材料为例，一般来说，必须从病畜中细小病毒最多的脏器和组织中采集疾病材料。 例如，上呼吸道疾病采集鼻分泌物，脑炎采集脑组织，痘病采集患部皮肤。 采集生病材料的时间，最好是刚出症状的时候。 在抗体检查时，采取家畜的初期和恢复期的血清，得知抗体滴度的变化。 三、病毒检测分离培养细小病毒与细菌不同，细小病毒是严格的活细胞球内寄生，因此分离培养细小病毒必须采用宿主(易激动)接种法鸡胚培养法细胞球培养法，经细小病毒要求选择，才能得到满意的结果。 (1)以寄主接种法分离的标本接种实验寄主的种类和接种途

8、径主要应考虑细小病毒寄主范围组织的需氧性和云同步操作、培养及结果判定的简便性，动物病毒标本可接种在敏感动物的特定部位：动物脑内接种嗜神经病毒的需氧道病毒可接种动物鼻腔的常用动物有实验动物：大鼠、大鼠本动物：细小病毒接种后，进行隔离喂养，每天观察动物的发病情况，根据动物症状化学基，初步确定有无细小病毒增殖。 实验动物接种1、实验动物培养细小病毒的优缺点3、实验动物接种细小病毒的用途2、实验动物的等级、普通级实验动物(CV )、清洁级实验动物(clean animals )特定病原动物(specific pathogen-free animals ) SPF )、无菌动物(germ-free an

9、imals，GF )、指生动物(gnotobiotic animals )鸡新城疫细小病毒应接种10d尿囊腔和羊膜腔的虫媒细小病毒应接种在5d卵细胞中。 继续培养观察。鸡胚接种1、鸡胚接种细小病毒的优点和缺点2、鸡胚的结构、接种途径和方法、鸡胚培养法的缺点1、一般细小病毒通常不使鸡胚产生特异性感染指征2 .蛋黄中充分含有对家禽病原体的母源抗体3 .一些病原体可以从感染的母鸡传播到鸡胚4 .通常鸡胚种是白血病、鸡胚结构、接种途径、1、绒毛尿囊膜接种：主要用于绒毛尿囊膜形成痘斑样病变的细小病毒。 1012年的接种日龄。 2、尿囊腔接种：主要用于接种正黏细小病毒和残奥黏病毒。 1011年接种日龄。

10、3、卵黄囊接种：主要用于虫媒膜细小病毒、立克次氏体与衣原体的接种。 68日龄的接种。 4、羊膜腔接种：正粘细小病毒和残奥黏病毒的接种。接种日龄为1012日龄，鸡胚接种后的结果是，1，24小时死亡的鸡胚不能丢弃，不认为是细小病毒增殖引起的致死。 2 .尿囊液清凉3、鸡胚死亡或鸡胚出现病变等异常；(3)细胞球培养法细胞球培养是目前最常用的方法。 将体外活组织用机械方法、胰蛋白酶等方法分散在单个细胞球中，平皿上形成贴壁的单层细胞球，铺上动物病毒混悬剂培养。 组织培养，1，概念：原指动物或植物组织小块的体外培养，现指体外组织、器官和细胞球培养。 组织(布摇滾乐)培养：将动物组织切成小的布摇滾乐，在固定

11、或悬浮条件下培养。 这种方法是最早的组织培养方法。 器官培养：取器官片(气管环)培养，基本维持原来的结构和功能。 细胞球培养：采用胰酶催化剂等细胞球分散液将动物组织消化在单个细胞球混悬剂，再加细胞球营养液进行生长繁殖。 组织培养、培养细胞球类型不同而不同1、原代细胞培养：从动物组织直接制备单细胞球的优点：细小病毒对天然宿主细胞球最为敏感。 适应病毒检测分离的缺陷：有时携带潜伏细小病毒，无菌取出动物组织，多次清洗，撕裂组织，清洗消化组织，机械吹走，纱布过滤，过滤细胞球混悬剂细胞球， 用稀释了培养液的胰蛋白酶和EDTA等细胞球分散剂将细胞球从培养瓶的玻璃面消化，使细胞球分散，再加入培养液，重新注入

12、培养瓶中，使细胞球生长成细胞球单层，这样传代后，细胞球的染色体与原代细胞的染色体数相同，成为二倍体细胞球培养或传代细胞培养优点：细胞球东鳞西爪少，潜伏细小病毒容易发现，对细小病毒的易感性与原代细胞相似。 缺点：不能无限制地传代，并非所有的细胞球都能传代。 组织培养，3，传代细胞系可以在体外无限制地传代。 这样的细胞球多属于癌变细胞球，有着很高的生长和增殖的优势，这样的细胞球的染色体已经发生了变化，也被称为异倍体细胞球。 优点：培养容易，生长快，容易获得和操作。 缺点：对病毒检测分离不敏感，不能用这种细胞球培养的细小病毒制造疫苗。 组织培养，根据培养方法1，静置培养方法简单，产量少，根据组织培养

13、，培养方法2，将转瓶培养(转管培养)细胞球混悬剂分注到圆瓶中，培养时瓶缓慢滚动(510转/分钟)的细胞球粘贴在瓶的周围，单层生长的细胞球的产量高组织培养，3，悬浮培养细胞球产量高，适应传代细胞球，不适合原代细胞培养，根据培养方法组织培养，根据培养方法4，微载体细胞球培养利用对细胞球无毒的微粒，按一定比例放入悬浮培养的营养液，作为细胞附着增殖的载体。 大幅度扩大了细胞球在单层附着面的生长，达到了利用生长空间和营养液提高细胞球产量的目的。 常用的细胞球培养、细胞球缩小：细胞球折光率增强，形态逐渐变圆，感染细胞球从局部向单层整体扩散，细胞球死亡，部分从玻璃面脱落。 细小病毒感染细胞球后的细胞球病变效

14、果(Cytopathic effect，CPE )、细小病毒感染细胞球后的细胞球病变效果(Cytopathic effect，CPE )、细胞球聚集成丛：类似葡萄串状。细胞球与细胞球之间丝状体细胞球间的桥连、细小病毒感染细胞球后的细胞球病变效果(Cytopathic effect，CPE )、多核巨细胞的形成：感染病毒的细胞、膜融合形成一个合胞体，内有多个核，病毒感染细胞后的细胞病变效果(cytopatte ) 有的细胞球内空泡形成：在细小病毒感染的细胞球内形成大气泡，细小病毒感染细胞球后细胞球病变效果(Cytopathic effect，CPE )，细胞球脱落：病变细胞球从玻璃表面脱落，进入

15、细胞培养液中，显着减少贴壁细胞，稀疏细胞的核内包涵体和细胞浆内包涵体细小病毒鉴定细小病毒鉴定是诊断细小病毒性疾病的可靠方法，也是细小病毒分类的前提。 一般而言，(1)细小病毒的群体形态特征1 .噬菌斑噬菌斑(plaque )测定通常采用双平板法，将经稀释的噬菌体混悬剂与一定量的高浓度敏感菌混悬剂及半固体琼脂培养基(1琼脂)混合均匀后，放入基底琼脂培养基(2琼脂)的各个噬菌斑就是噬菌体感染的结果， 由于噬菌斑中噬菌体的遗传性被认为是相同的，因此通过重复多次接种可以获得纯系噬菌体。 各噬菌体的噬菌斑具有一定的大小、形状、边缘和透明度，可以作为鉴定的指标。 另外，噬菌斑也可以用于细小病毒的定量。 1

16、、噬菌斑、2 .菌苔、2 .空斑和感染病灶的一部分动物病毒在动物细胞球或组织培养系统下培养时，由于细小病毒感染细胞球分裂，出现了与噬菌斑相似的空斑或蚀斑。 如果是肿瘤细小病毒，细胞球不是被溶解，而是成长速度增加，被感染的细胞球堆积形成像菌落一样的感染病灶。 3 .枯斑一部分植物病毒病在茎、叶等植物组织上形成一个脱绿或坏死的斑块称为枯斑或坏死斑。 (2)凝血现象和干扰现象凝血现象是指多种细小病毒吸附凝集于一定种类的哺乳动物或鸟类血红细胞表面的现象。 流感细小病毒天花细小病毒等。根据细小病毒凝集的血球的种类和凝集条件，可以鉴定细小病毒。 当两种不同的细小病毒云同步或相继感染同一宿主细胞球时，一个细

17、小病毒抑制另一个细小病毒增殖的现象被称为细小病毒干涉现象(interference )。 例如，乙型脑炎细小病毒可干扰脊髓灰质炎细小病毒，而流感细小病毒可干扰西方型马脑炎细小病毒的增殖。 如果在某个组织的细胞球培养物中向云同步中添加可与接种物干扰的细小病毒并抑制后者，则可间接判断在接种物中存在可与后者干扰的细小病毒。 (三)细胞球病变效应(CPE )是指细小病毒在细胞球内增殖，损伤细胞球的显着表现，如：细胞球发生冷凝、凝集、肿大，细胞球融合形成多核现象，细胞球脱落、分裂，细胞球内出现包涵体等。 用于细胞球培养的标本一般以细胞球病变效果作为细小病毒感染的指标。 细胞球病变是特定细小病毒和细胞球相互作用的结果，不同的细小病毒感染同一细胞球可能呈现不同的细胞球病变效果，相同的细小病毒即使在不同的细胞球下也可能引起不同的效果。 培养液成分、温度、感染细小病毒时的细胞球年龄等也对细胞球病变效果(CPE )有影响。 单细胞融合现象细胞融合现象(phenomenon of cell fusion )是指细小病毒感染宿主细胞球而出现的多核细胞现象。 2 .包涵体的一些细胞球感染细小病毒后出现在细胞质或细胞核内，在光学镜下可见、大小、形态及数量不同的小体被称为包涵体