设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案

1、设计碱性磷酸酶的提取、分离纯化方案及采用每种技术的原因， 在分离纯化过程中怎样检测纯度？,PPT制作：颜佩妮 PPT演讲：朱泉剑 资料收集：吴倩艳、宋琴琴,目录,碱性磷酸酶的概念 碱性磷酸酶的提取、分离、纯化,碱性磷酸酶的纯化程度鉴定 碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术的原因,碱性磷酸酶的概念,碱性磷酸酶是动物和微生物界普遍存在的一种含锌酶，它在物质代谢中起着重要的作用。碱性磷酸酶能催化几乎所有的磷酸单酯进行水解，产生无机磷和相应的醇、酚或精，但却不能水解磷酸H酿类 碱性磷酸酶广泛分布于人体各内脏器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织。在碱性条件下能水解多重磷酸单脂化

2、合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。,回,实验原理,1. 动物肝脏中含有丰富的碱性磷酸酶（AKP）。2. 在正丁醇中脂类不溶而蛋白质溶解，可以借此除去与酶结合的脂类（酶也是蛋白质）。3. 有机溶剂分步沉淀法纯化,有机沉淀法,实验采用有机溶剂分步沉淀法,从兔肝中提取碱性磷酸酶. AKP溶于30%乙醇或33%丙酮。但在60%的乙醇或50%丙酮中则形成沉淀。通过离心可以使AKP和其他蛋白分离，从而得到纯化。 反复进行纯化的操作，可以获得较高纯度的AKP。,常用的有机溶剂,乙醇:沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析. 丙酮:沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广.

3、 正丁醇:能去除与pro结合的脂类物质，使pro溶解 在溶液中.,称取新鲜兔肝（可使用猪肝）2g。,分离纯化 AKP步骤,将1g新鲜兔肝置于70冰箱进行预先冷冻处理后取出，置于玻璃匀浆器内。加入0.01mol/L醋酸镁、0.01mol/L醋酸钠混合溶液3mL，充分研磨至糊状。,将匀浆液倒入刻度离心管中，使用4ml上述混合缓冲液冲洗研磨器具，将冲洗液一并转入离心管。离心管一定要置于冰块保护下，以后各个步骤也要注意保持低温。,加1mL正丁醇于匀浆原液中，用玻棒充分搅匀，然后放置冰浴中20min。用滤纸过滤，滤液置于另一支刻度离心管中。,过滤，滤液也要冰块保护,滤液中加入等体积的冷丙酮，立即混匀后离

4、心2000r/min5min，弃去上清液。在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁2mL用玻棒充分搅拌使其溶解，记录溶液体积。,立即混匀后使用台式低速离心机离心5min(2000 r/min)，弃上清液。,向沉淀中加入4.0mL05mol/L 醋酸镁溶液，充分搅拌使其溶解，同时记录悬液体积向上清液中加入95冷乙醇，使乙醇终浓度达60，混匀后立即离心5min(2500r/min)，弃上清。 向沉淀中加入40m1 0.0lmol/L 醋酸镁一0.01mol/L 酸酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。向上余悬液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终浓度达33，混匀后离心5min(2000r/min)，弃去沉淀,回,AKP纯

5、化程度鉴定,纯化程度用酶的比活性反应。 酶比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。,碱性磷酸酶的活性测定磷酸笨二钠法,在pH10环境中，AKP催化磷酸苯二钠水解生成苯酚和磷酸氢二钠，苯酚与4-氨基安替比林反应生成色素原，该色素原经铁氰化钾氧化生成红色醌亚衍生物。 测定红色衍生物的吸光度就可以计算酶活性的大小。,AKP的蛋白含量测定BCA法则,蛋白质+Cu 2 利用分光光度计测吸光度 设计标准曲线计算蛋白质含量,碱性,Cu,BCA试剂,紫色化合物,1、AKP比活性： AKP比活性（U/mg）= 2、纯化倍数 纯化倍数 =,每ml制剂中AKP活性单位数（U）,每ml制剂中蛋白质含量（mg）,溶液

6、A制剂AKP比活性（U/mg）,每一制剂AKP比活性（U/mg）,回,碱性磷酸酶提取、分离纯化时采用的各种技术的原因,通过低温预冷处理有机溶剂分级提取兔肝碱性磷酸酶，结合SDS PAGE法检测纯化结果。对酶的比活力测定中蛋白定量经过对Bradford法和Folin Lowry法进行比较发现Folin Lowry法在本样品体系中灵敏度高、抗干扰能力强，适合采用此法进行蛋白含量测定。 盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（20，每升可溶760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。福林-酚试剂显色法用来测定蛋白质浓度。,离子交换层析法的原理,阳离子交换膜可以看作是一种高分子电解质,他的高分子母体是不溶解的,而连接在母体上的磺酸集团带有负电荷和可解离离子相互吸引着,他们具有亲