1.1 DNA重组技术的基本工具.ppt

1、生物 选修3现代生物科技专题,目 录,专题1 基因工程 专题2 细胞工程 专题3 胚胎工程 专题4 生物技术的安全性和伦理问题 专题5 生态工程,专题1 基因工程,基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破 1.DNA是遗传物质的证明 2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立 3.遗传密码的破译,技术发明使基因工程的实施成为可能 1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现 3.DNA合成和测序技术的发明 4.DNA体外重组的实现 5.重组DNA表达实验的成功 6.第一例转基因动物问世 7.PCR技术的发明,基因工程的概念,基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。通俗

2、地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因拼接技术或DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,人类需要的基因产物,剪切, 拼接, 导入, 表达,基因重组,基因工程的概念,转基因抗虫棉花,转入苏云金杆菌的一个抗虫基因，是中国目前最主要的转基因作物。,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,与运载体DNA拼接 导入,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？,关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来。 关键步

3、骤二： 抗虫基因与运载体DNA连接。 关键步骤三： 抗虫基因导入受体（棉花）细胞。,通过观察抗虫棉的培育过程，你认为关键的步骤是什么？,关键步骤一的工具：基因的剪刀限制性内切酶。 关键步骤二的工具：基因的针线DNA连接酶。 关键步骤三的工具：基因的运输工具运载体。,1.1 DNA重组技术的基本工具,基本工具： 限制性核酸内切酶“分子手术刀” DNA连接酶“分子缝合针” 基因进入受体细胞的载体“分子运输车”,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。能将外来的DNA切断，由于这种切割作用是在DNA

4、分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶。,4000种。,形成两种末端,限制性核酸内切酶,什么叫磷酸二酯键？,T,磷酸二酯键,A,大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别 GAATTC序列，并在G和A之间切开。,限制酶,什么叫黏性末端？,限制酶,什么叫黏性末端？,被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。,什么叫黏性末端？,什么叫平末端？,当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。,切割DNA分子时产生的两种不同末端,限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基

5、还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,7,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称排列的。,用同一种限制性酶处理不同DNA片段，会形成同样的黏性末端，可进行重组。,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，限制酶是原核生物的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，使之失效，达到保证自身的安全的目的。,限制酶在原核生物中的作用是什么？,因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解；含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到

6、所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。,为什么细菌中限制酶不剪切本身的DNA？,Ecoli DNA 连接酶 T4 DNA 连接酶,DNA连接酶,作用部位：,磷酸二酯键,DNA连接酶可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，即把梯子两边扶手的断口连接起来，这样一个重组的DNA分子就形成了。,DNA连接酶,区别： Ecoli DNA 连接酶 只能将双链DNA片段互补的粘性末端之间连接起来，不能将双链DNA片段平末端之间进行连接 T4 DNA 连接酶 既可“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端，但连接平末端之间的效率比较低,DNA连接酶,DNA连接酶与DNA聚合酶是

7、一回事吗？,相同点： 两者都是形成磷酸二酯键。 不同点： DNA连接酶:是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板。 DNA聚合酶:是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接到正在合成的DNA单链中，形成一条与模板链互补的DNA链；,基因进入受体细胞的运载体,常用运载体：质粒、 噬菌体衍生物、 动植物病毒 质粒 存在：主要存在于细菌的染色体以外。 特性：是很小的环状DNA分子，在细胞染色体外能够自我复制。,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,大肠杆菌质粒的分子结构示意图,作为运载体的条件：,（1）必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到运载体上去。 （2）必需具备

8、自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 （3）必需带有标记基因，以便重组后进行重组DNA分子的辨认和筛选。,（4）必需是安全的，不会对受体细胞有害，也就是能够安全地“借居”在受体细胞中。 （5）分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,课本知识回顾,基因工程又叫做 或 。通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 提取出来，加 以 ，然后放到另一种生物的细胞里， 改造生物的遗传性状。,基因拼接技术,DNA重组技术,基因,修饰改造,定向地,“分子手术刀” ,“分子缝合针” ,“分子运输车” ,限制酶,DNA连接酶,基因进入受体细胞的载体,限制性核酸内切酶,主要是从 的一种酶。 识别双链DNA 分子的某种 ，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的 断开。