1.1 离心技术2012.ppt

1、1 生化分离方法,生物化学实验中常常涉及细胞成分的生化分析或某种物质的制备，因此，必需利用有效的生物化学分离方法，常用的方法有：离心技术、层析技术、电泳技术和膜分离技术。,1.1 离心技术,1.1.1 基本原理 离心技术（centrifugal technique）是根据颗粒在作匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为而发展起来的一种分离技术。,？,影响颗粒在离心场中的沉降速度的因素有： 颗粒半径rp、颗粒形状（影响摩擦力f）、颗粒与介质的密度差（p- m）、一定温度条件下悬浮介质的粘度系数（）、离心加速度2r。 在确定的离心操作中，沉降速率则主要取决于悬浮颗粒受到离心力的大小。,离心力（ce

2、ntrifugal force，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度2r与颗粒质量m的乘积，即： ：是旋转角速度(弧度/秒)； r ：颗粒离开旋转中心的距离(cm)； m ：质量(克)。,相对离心力（relative centrifugal force，RCF） 离心力因离心管至旋转轴的距离不同而不同，因此用“相对离心力” 表示离心力，若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。,RCF是离心场转化为重力加速度的倍数。 r：离心转子的半径距离（cm）； g：重力加速度（980cm/sec2）； r

3、pm ：转子每分钟的转数。,Dole和Cotzias制作了与转子速度和半径相对应的离心力的转换列线图。 在用图将离心机转数换成相对离心力时，先在离心机半径标尺上取已知的离心机半径和在转数标尺上取已知的离心机转数，然后将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点，即为相应的离心力数值。,例已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500g即是RCF值。 相对离心力(g)RCF=1.11910-5rrpm2。,1.1.2 离心分离方法,1.1.2.1 差速离心法 利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别，在同一离心条件下，沉降速度不同，通过不断

4、增加相对离心力，使一个非均匀混合液内的大小、形状不同的粒子分部沉淀。 操作过程中一般是在离心后用倾倒的办法把上清液与沉淀分开，然后将上清液加高转速离心，分离出第二部分沉淀，如此往复加高转速，逐级分离出所需要的物质。,差速离心的分辨率不高，沉淀系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。 关键是选择适合于各分离物的离心力。 例如用差速离心法分离已破碎的细胞各组份。,1.1.2.2 速率区带离心法,速率区带离心法是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl2等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。,离

5、心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大； 但介质最大密度必须小于样品中粒子的最小密度，即Pm。 这种方法是根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同，使具有不同沉降速度的粒子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带，达到彼此分离的目的。,1.1.2.3 等密度离心法,等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液顶上或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。,当管底介质的密度大于粒子的密度，即mP时粒子上浮；在

6、管顶处Pm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即Pm，此时dx/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。 与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其他参数无关。,体系到达平衡状态后，延长离心时间和提高转速也不能改变粒子的成带位置。 但提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl2。,1.1.3 离心设备,离心机可为工业用和实验用离心机。实验用离心机又分为制备性和分析性离心机。 制备性离心机主要用于分离各种生物材料和分子，分离的样品容量比较大。 分

7、析性离心机一般都带有光学系统，用于研究生物大分子和颗粒的理化性质。分析性离心机都是超速离心机。,1.1.3.1 离心机的种类,普通离心机：转速20006000rpm，RCF可达6000g；容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，转速控制不严格，一般无制冷系统，用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。,普通离心机以交流电动机驱动，电机碳刷易磨损，利用电压调压器调节转速，起动电流大，速度升降不均匀，一般转头是置于一个硬质钢轴上，因此必需进行精确平衡，以免损坏离心机。,高速离心机：转速2000025000rpm，RCF可达89000g，最大容量可达3升，分离形式是

8、固液沉降分离。,超速离心机：转速5000080000rpm，RCF可达600000g；离心容量由几十ml至2L，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，可进行亚细胞器分级分离，病毒、核酸、蛋白质和多糖等生物大分子的分离。 按性能可分为分析型、制备型和分析制备型三种。,1.1.3.2 离心机的组成及使用,离心机一般由：主机、转头、离心管组成。,角式转头：离心管腔与转轴成一定倾角的转头。,缺点：由于颗粒在沉降时先沿离心力方向撞向离心管，然后沿管壁滑向管底，因此管的一侧会出现颗粒沉积而产生“壁效应”，壁效应易使沉降颗粒受突然变速所产生的对流扰乱而影响分离效果。,水平式转头：转头是由吊着的4或6个

9、自由活动的离心套管构成。当转头转速达到200800rpm时，吊桶荡至水平位置，适用于密度梯度区带离心。,优点：梯度物质可放在保持垂直的离心管中，离心时被分离的样品带垂直于离心管纵轴，有利于离心结束后由管内分层取出已分离的各样品带。 缺点：颗粒沉降距离长，离心所需时间也长。,垂直转头：其离心管是垂直放置，样品颗粒的沉降距离最短，离心所需时间也短，适合用于密度梯度区带离心。,连续流动转头：可用于大量培养液或提取液的浓缩与分离，转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成，离心时样品液由入口连续流入转头，在离心力作用下，悬浮颗粒沉降于转子桶壁，上清液由出口流出。,离心管主要以塑料

10、、玻璃或不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，PP管性能较好。,1.1.4 使用离心机的注意事项,离心时要保证离心管的对称平衡。 例如，当离心转速达1000050000rpm时，如果对称管相差1g，转头半径5cm，根据离心力公式： F=mRCF，查表 10000rpm时的RCF=6000，代入公式 F=16000=6kg 50000rpm时RCF=150000，F=150kg 此时引起两边不平衡可达6150kg，对离心机将造成很大的损伤，缩短离心机的使用寿命。,1.1.5.1 普通离心机注意事项,离心前必须仔细检查转头各孔内有无异物。 离心管必须仔

11、细，对称平衡。 机内若不清洁，离心管要用塑料薄膜封口。 必须慢起动，然后逐渐加速。 离心时不准打开离心机盖。 停止离心时不许用手刹车。,1.1.5.2 高速冷冻离心机注意事项,未经过培训和考核者不能使用。 选择合适的转头和转速，绝不可超速使用。 选择合适的温度，通常4，除有机溶剂外不要低于零下，以免冰冻，损坏离心管和转头。,离心管内装载的溶液量必须合适，不锈钢管无盖，只能装2/3，塑料管可装至“肩”部。管盖需盖严不能漏液。若离心管盖密封性差，液体不能加满（高速离心且使用角度头），防止外溢失去平衡和污染转头及离心腔。 空管离心会变形。塑料管使用有机溶剂必须符合规定。,由于超离时需抽真空，因此液体一定要加满离心管，以避免离心管变形。 使用角度头时要加转头