基因工程的主要技术与原理-核酸分离电泳

1、生物技术专业核心课程,基 因 工 程,F 基因的化学合成,D 分子杂交技术,A 核酸的分离和纯化,B 核酸电泳,3. 基因工程的主要技术及原理,C PCR技术,E DNA核苷酸序列分析,第一节 核酸的分离和纯化,一、DNA的分离、检测和纯化,DNA的来源及用途,染色体DNA:分子巨大，1000Kb-106Kb。 是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料； 也可用于构建染色体载体和染色体基因整合平台。,(Isolation and Purification of nucleic acid),染色体DNA比较,细胞器DNA:主要指线粒体DNA和叶绿体DNA,是真核 生物所特有的染色体外遗传物质，

2、分别含有与呼吸 作用和光合作用相关的基因。可用于分离目的基因 和构建克隆载体。,叶绿体DNA比较,线粒体DNA比较,病毒和噬菌体DNA:主要用于构建基因克隆载体， 可承载较大片段的外源DNA。,质粒DNA:为染色体外遗传物质；分子大小1Kb-几百 Kb不等，具有复制起始位点，可自我复制。主要用于 构建基因克隆载体。,DNA提取的一般程序,供体细胞培养,收集(菌体)细胞,细胞破碎,分离总DNA,细胞器DNA的分离、纯化,总DNA的抽提、纯化,分离细胞器,1.化学法：,细胞裂解方法,酶解:利用酶在温和的条件下，有选择性地破坏细 胞膜系统。溶菌酶、溶壁酶、纤维素酶、果胶酶等。,2)增溶：利用表面活性

3、剂的增溶作用破坏细胞膜系统。 常用的表面活性剂有十二烷基磺酸钠(SDS)、十六烷基 三甲基溴化铵(CTAB) 。,2.机械法：,1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌 2)匀浆法：搅切器(blender)，混合器(mixer)， 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球同时致冷， 在未融熔前用研杵磨成粉末 4)超声波法：利用频率高、波长短的超声波进行 细胞破碎，效率更高,3.其它方法：,1)煮沸法： 2)冻融法： 3)干燥法：,植物总DNA的提取,一般地说，总DNA主要是指基因组DNA(genomic DNA), 即细胞核内的染色体DNA分子。,核DNA分子呈极不对称的线状结构,一条染

4、色体为一个 DNA分子。高等植物核DNA大约含有109bp，其长度与直径的比例极不对称，使其对机械力十分敏感。很难分离出它的完整分子。分离纯化过程中，DNA分子的断裂是很难避免的。,为了尽可能获得大分子量的DNA，一般采用去污 剂温和处理法，对于细胞破碎较困难的植物材料， 可以辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。,植物总的提取方法从提取原理上主要有以下两种：,对于基因组文库的构建及Southern杂交，应尽量 使用片段较长的DNA分子。,CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵) SDS法(十二烷基磺酸钠),1.CTAB法原理,CTAB,高盐溶液(0.7mol/L NaCl),CTAB,CTAB,

5、CTAB,核酸,蛋白质,多糖,低盐溶液(0.3mol/L NaCl),上清液,沉淀,CTAB,核酸,CTAB,核酸,核酸,核酸,核酸,核酸,乙醇或异丙醇溶液,核酸,上清液,沉淀,CTAB(cetyltrimethyl ammonium bromide,十六烷 基三乙基溴化铵)是一种去污剂，可溶解细胞膜，能 与核酸形成复合物；,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液， 再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶于乙醇。,在高盐溶液（0.7mol/L NaCl）中是可溶的，当降 低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/L NaCl）时从溶 液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同白 质、多糖

6、类物质分开；,1.CTAB法原理,2.SDS法原理,其原理是利用高浓度的SDS（十二烷基硫酸钠 在较高温度（55-650C）条件下裂解细胞，使染 色体离析、蛋白质变性，释放出核酸；,在低温、高盐条件下，使蛋白质及多糖沉淀 (常是加入5mol/L的乙酸钾冰浴，使乙酸钾与 蛋白质及多糖结合成不溶物)。,离心除去沉淀后。上清液中的DNA进行反复 抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法操作简单、温和，也可提取到高分 子量的DNA，但所得产物含糖类杂质较多。,CTAB法的最大优点是能很好地去除糖类杂 质，对于含糖较高的材料可优先使用。,3.CTAB与SDS,4.基因组总DNA法提取程序,1

7、)液氮研磨材料成粉末，置于离心管中 再加入适量2CTAB提取液，充分混匀， 65水浴1hr；,2) 4，12000 r/m，离心10 min，吸 取上清液转入新的离心管；,3)加入等体积的酚/氯仿，充分混匀， 静置5min后于4、12000 r/min，离 心10min；,裂解细胞膜,沉淀材料残渣,变性、沉淀 蛋白质,5)将上清液转入另一离心管，加入等体积 异丙醇（或两倍体积冷乙醇），混匀，冰 浴20-30 min，沉淀DNA；,6)挑出絮状DNA沉淀，70%乙醇中洗涤2次；,7)无水乙醇洗涤1次；,8)风干后，加适量TE缓冲液或无菌双蒸水 溶解DNA，-20贮存备用。,4)将上清液转入另一离

8、心管，加入等体积 氯仿，充分混匀，4、12000 r/min，离 心10 min；,进一步变性、沉淀 蛋白质，清除残余 苯酚,沉淀DNA,洗涤、干燥DNA,溶解、保存,DNA电泳结果,大肠杆菌质粒DNA的提取,克隆载体分子及装载于载体中的克隆化 基因，大多是以质粒的形式保存在大肠杆 菌中，因此，许多基因操作都离不开大肠 杆菌质粒DNA的提取，其步骤主要有3个：,细菌的培养 细菌的收集和裂解 质粒DNA的分离和纯化,碱裂解法提取E.coli质粒DNA程序及原理,1.将菌落转接入约5ml含相应抗生素的LB液体 培养基中，37恒温振摇，培养过夜(12hr)；,2.取1.5 ml培养物转入微量离心管中

9、，4， 12000 r/min离心30 sec，倒掉培养液，尽可 能清除残余液 (可重复2-3次) ；,3. 弃培养液，使细菌尽可能干燥；,细菌的培养,菌体的收集,4.将细菌沉淀重悬于200l冰预冷的溶液I中， 剧烈振荡；,5.加入400l新配置的溶液II，快速颠倒离心 管数次，混匀后，将离心管置于冰上3-5 min；,溶液I： 50mM葡萄糖/25mM Tris-Cl/10 mM EDTA，pH 8.0；,悬浮菌体,溶液II： 0.2N NaOH/1% SDS；,裂解菌体细胞,充分悬浮， 避免结块。,控制时间；,操作柔和。,6.加入300l冰预冷的溶液III，后温和振荡 10秒钟，混匀后，置

10、于冰上3-5min；,溶液III： 3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸,质粒DNA的分离,中和NaOH；,沉淀蛋白质和 基因组DNA。,7.4，12000 r/min离心5min，将上清转至 另一离心管中； 8.加入等体积的酚/氯仿，振荡混匀，4， 12000r/min离心5min，将上清转至另一离心 管中； 9.加入等体积的氯仿混匀，4，12000r/min 离心5min，将上清转至另一离心管中；,进一步变性、沉淀蛋白质,14.风干后，溶于20-50lTE缓冲液或无菌 双蒸水中； 15.加入适量无DNA酶的RNase(20g/ml)， 37处理30min； 16.琼脂糖凝胶电泳检测后，-20贮

11、存备用。,沉淀、洗涤DNA,也可用等体积异丙醇沉淀质粒DNA；,10.加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混匀， 置于冰上沉淀DNA； 11.4，12000 r/min离心15 min； 12.小心吸去上清，将离心管倒置于吸水纸 上，使所有液体流出； 13.70%乙醇洗涤DNA沉淀；,溶解备用,消化RNA,适度干燥；,质粒DNA电泳结果,1.共价闭合环状超螺旋(covalently closed circular DNA, ccc-DNA),超螺旋,线状分子,3.开环螺旋(open circular DNA, oc-DNA),2.线状DNA(linear DNA, l-DNA),开环螺旋,二、RNA的

12、分离和纯化,一个典型的哺乳动物细胞约含10-5ugRNA，其 中，80-85%为rRNA(28S、18S和5S三种)；其余 15-20%为各种低相对分子量RNA，如tRNA、核内 小分子RNA等，而mRNA只占1-5%。,mRNA是单链的，极易受到核酸酶的攻击而导致 降解。对RNA的操作要求比DNA更为严格。,（一）控制潜在的RNA酶活性,2)解决办法：,1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒(0-65均具活性)；抗变性剂。,湿热灭菌：一次性用品，如微量移液吸头(tip)、微 量离心管(eppendorf tube)等，先用0.1%的焦磷酸二 乙酯(DEPC)处理过的

13、水浸泡过夜后，121湿热灭菌 30min;,干热灭菌：耐热器皿，如玻璃制品、研钵、镊子等， 可在180-200高温干热灭菌4hr以上；,电泳用具：最好专用；用前洗涤剂清洗干净，再用 3%H2O2和0.1%的DEPC水浸泡后，冲洗干净方可使用。,操作者防护：实验过程中必须带手套，并常换手套， 尽量避免外源RNase的污染；,内源RNase：采用高温抽提，提取液中添加强蛋白质 变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等。,（二）RNA的抽提和纯化,1)酚-异硫氰酸胍抽提法：,异硫氰酸胍(GIT)与b-巯基乙醇共同作用可抑制 RNase活性；,GIT与十二烷基肌氨酸钠共同作用可使蛋白质变 性，从而释放RN

14、A；,在酸性条件下，DNA极少发生解离，而是同蛋白 质一起沉淀，RNA则保留在上清液中而得到分离；,2)硅胶膜纯化法：,RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与 DNA纯化思路相似；,当含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA 被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开；,在低盐浓度条件下，RNA被洗脱液洗脱下来；,（三）mRNA的纯化,Northern杂交可以使用总RNA,而构建cDNA文库 时，则必须得到纯化的mRNA；,亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3端的 poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开 发出许多用于mRNA纯化的层析柱。,RNA电

15、泳结果,28S rRNA,18S rRNA,三、核酸的评价,1.核酸纯度评价：,DNA样品： OD260/OD280=1.8 较纯； OD260/OD2801.8 可能有RNA污染； OD260/OD2801.8 有蛋白质污染；,RNA样品： OD260/OD280=2.0 较纯； OD260/OD2802.0 可能有异硫氰酸残存 ； OD260/OD2801.7 有蛋白质或酚污染,2.核酸浓度估算：,当OD2601时， SSDNA= 37g/ml dSDNA= 50g / ml SSRNA= 40g / ml 寡核苷酸浓度约为30g / ml,(Nucleic Acid Gel Electr

16、ophoresis),第二节 核酸的凝胶电泳,优点： （1）便于分离； （2）便于检测； （3）便于回收。,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一， 用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段；,电泳：带电物质在电场中向相反电极 移动的现象称为电泳。,一、核酸凝胶电泳的基本原理,核酸分子骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态； 核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正 电极方向迁移；,因此，可在同一凝胶中、一定电场强度下、在凝 胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有 差异的核酸分子。,电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成 反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数；,一、琼脂糖凝胶电泳Ag

17、arose gel electrophoresis,检测DNA是否真的存在，是否有降解现象，DNA经 限制性内切酶酶切后其产物的大小。目前最成熟 的检测 DNA 的技术是琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖从 海藻中提取的一种线状高聚物，在0.7%的琼脂糖 浓度下，对0.8-10kb的DNA有最佳的分离效果。,（一）凝胶的制备及电泳,琼脂糖分子式,琼脂糖(Agarose)：是从红色海藻中提取的一种 线状多糖高聚体。,琼脂糖凝胶制作过程,（二）DNA的迁移速率决定因素,双链DNA分子迁移的速率 与其碱基对数的常用对数 近似成反比；,同一分子：超螺旋环状 线状缺口环状。,1.DNA分子的大小和构象,2.琼脂糖浓

18、度和种类,浓度越低，相同核酸 分子迁移越快；,常见的有两种：标准 琼脂糖和低熔点琼脂糖；,5000,不同类型琼脂糖的性质,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,3.凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷 减少、刚性和长度增加。,5.所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比；,6.电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE。,TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较,1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时 凝胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或T

19、PE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE， 对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的 电泳分辨率要好于TBE。,（三） 凝胶载样缓冲液,载样缓冲液：在上样到凝胶加样孔之前与 待电泳的样品相混合的一种缓冲液。,载样缓冲液有三个作用：,增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 使样品带有颜色便于简化上样过程； 可以指示电泳进程。,6凝胶载样缓冲液,指示剂:,溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，在不同浓度凝胶 中，迁移速度基本相同。在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂 糖凝胶电泳中，溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、 0.2Kb和0.15

20、Kb的双链线性DNA片段大致相同。,二甲苯腈的水溶液呈兰色，携带的电荷量比溴酚兰 少，迁移的速度比溴酚兰慢，它在1%和1.4%琼脂糖中 电泳时，其迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA 大致相似。,（四）琼脂糖凝胶中DNA的检测,通过染色, 紫外灯下检测。,主要染料： 溴化乙锭（ethidium bromide, EB） SYBR Gold,1.凝胶的EB染色,EB的分子式,EB的染色原理,溴化乙锭是一 种具扁平分子的 核酸染料，可以 插入到DNA或RNA 分子的碱基之间,使用EB染色注意事项,（1）EB被认为是一种强致癌物质,（2）EB可用来检测单链或双链核酸,（3）EB常用水配制

21、成10 mg/ml的贮存液，于室 温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使 用终浓度为0.5g/ml。,（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在 无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。,2 凝胶SYBR Gold的染色,SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。 其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极 大增强荧光信号。,（五） 凝胶中DNA的成像,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像， 图像可以直接输出到计算机观察。,Gel Doc 2000 Systems and Accessories,（六） 凝胶中DNA的回收,现一般采用试剂盒回收。,存在的主要问题：,不能有效的

22、回收大片段DNA 不能有效回收少量DNA,二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE,在四甲基乙二胺(TEMED)催化过硫酸铵还原产生的 自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚 丙烯酰胺的线状长链。,（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质,在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与 下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状 网格结构。,网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联 剂的浓度。,CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺）,（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1.变性聚丙烯酰胺凝胶,用于单链DNA片段的分离或纯化、DNA测序 反应等。,变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关，只与分子大小有关。,2.非变性聚丙烯酰胺凝胶,迁移率受其碱基组成和序列的影响。,用于双链DNA片段的分离和纯化、制 备高纯度的DNA片段。,（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-