1 质粒DNA的提取ppt课件

1、质粒DNA的提取,碱裂解法,什么是质粒(plasmid)? 细菌细胞染色体以外，能独立复制并稳定遗传的共价闭合环状DNA分子。,染色体DNA,质粒DNA,目的要求,学习用碱裂解的方法从大肠杆菌中小量提取质粒DNA的方法和原理。,实验原理,质粒是存在于大多数细菌染色体以外的能独立复制的双链环状DNA分子，是携带外源基因进入受体细胞繁殖与表达的重要载体，经常需小量制备。碱裂解法提取质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异来达到分离目的。,质粒DNA的提取和纯化步骤,收集细菌 使菌体裂解 分离出质粒 进一步纯化,1.溶液I（pH8.0,50mol/L葡萄糖，25mmol/LTris

2、-HCL，10mmol/L1EDTA ) 2.溶液II （pH12.6, 1% SDS , 0.2mol/L NaOH) 3.溶液III（pH4.8,5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml) 4.苯酚/氯仿/异戊醇:25:24:1 5.无水乙醇 6.70%乙醇 7.TE液（pH8.0,10mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA,含20ug/ml Rnase A）,操作步骤 p163,质粒DNA的小量制备（碱裂解法） 过夜培养液1.5mL,8000RPM离心2min，收集菌体 溶液I （葡萄糖、 TE、 EDTA )100uL重悬菌体 溶液II （SDS

3、 、 NaOH)200uL 轻柔颠倒混匀 溶液III（乙酸钾、冰乙酸) 150uL,颠倒混匀,冰浴5min 8000rpm离心5min、吸取上清液于新的EP管中， 加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇混合液 8000rpm离心5min，上清液加入2-2.5倍体积无水乙醇，冰浴10min 10000rpm离心10min，弃上清，沉淀加入70%乙醇1mL 10000rpm离心5min，弃上清，沉淀干燥 得到的质粒DNA用TE液（含Rnase A ）溶解，消化RNA即得不含RNA的质粒DNA，用于酶切和琼脂糖凝胶电泳鉴定。,注意事项,1.高速离心机使用相关注意事项； 2. 加入溶液I后要使菌体完全重悬； 3

4、.加入溶液II和溶液III后，温和上下颠倒混匀溶液，以防DNA断裂； 4. 注意分层的有机相和水相；,思考题,1.质粒DNA的纯化常用碱裂解法,其中EDTA、SDS、酚的作用分别是什么？ 2.核酸的纯化中，无水乙醇和70%的乙醇的作用分别是什么？,EDTA的作用是: 抑制Dnase的活性, 降低细胞膜的稳定性 SDS的作用是: 溶解细胞膜和核膜, 并使蛋白变性 酚的作用是: 变性沉淀蛋白,抑制DNase的活性 氯仿的作用是:加速有机相和水相分层 异戊醇的作用是：消除因蛋白质变性而产生的泡沫，从而稳定两相界面 pH8.0的Tris溶液（TE）的作用是:保证抽提时DNA进入水相, pH8.0可防止DNA变性 无水乙醇作用: (在有盐的条件下)沉淀核酸 70%乙醇作用: 去除共沉淀的盐,实验报告要求,实验报告按下列要求书写,1. 实验题目当次实验 2. 实验原理简明扼要，有针对性 3. 操作