第7章 化学致突变 卫生毒理学.ppt

1、化学致突变作用,Chemical-induced Mutagensis,2009年11月,介绍内容,基本概念 化学致突变作用的类型 化学致突变作用的机制及后果 突变的后果 机体对化学致突变作用的影响 观察化学致突变作用的基本方法,基本概念, 遗传（heredity）：物种通过各种繁殖方式保证世代间生命延续的过程。 变异（variation）：亲子之间或子代个体之间出现不同程度的差异。 致突变作用（mutagenesis）：外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质DNA发生改变的能力。, DNA与基因： DNA：遗传信息储存之处，大分子，由脱氧 核糖、磷酸及碱基组成 基因： DNA分子中最

2、小的具有完整功能的单位 染色质与染色体：由相同物质组成：DNA + 组蛋白 + 非组蛋白 + 少量RNA 核型：将体细胞的全部染色体按大小形态等方式排列起来即构成细胞核型。,人类染色体核型 荧光染色照片,人类染色体核型照片,染色体结构,DNA分子模型,中心法则, 突变（mutation）：遗传结构本身的变化及引起的变异，是遗传物质的一种可遗传的变异，是致突变作用的后果。 基因突变（gene mutation）：一个或几个DNA碱基对的改变； 染色体畸变(chromosome aberration)：染色体数目及结构的改变。 致突变物(mutagen)：能够引起突变的物质。, 体细胞和生殖细胞：

3、 体细胞：癌变 生殖细胞：突变可以传给下一代。 显性突变：纯合或杂合表型均异常 隐性突变：纯合表型异常；杂合表型 正常，为携带者 基因型与表型： 基因型：控制生物性状的基因组成 表型：在发育过程中，由基因所控制的生 物形状的具体表现,细胞分裂周期,有丝分裂,减数分裂,化学毒物致突变类型： 基因突变 1.碱基置换（base substitution）:指某一碱 基配对性能改变或脱落所致的突变。 转换：嘌呤嘌呤 嘧啶嘧啶 颠换：嘌呤嘧啶 嘧啶嘌呤 2.移码突变（frameshift mutation）:指发生一对或几对（3对除外）的碱基减少或增加，以至受损点开始碱基序列完全改变。 染色体畸变(ch

4、romosome aberration): 结构改变 非整倍体与多倍体（aneuploid and polyploid）：数目改变,点突变模式图,移码突变模式图,染色体结构异常类型：,1、缺失 deletion-del 2、易位 translocation-t 3、等臂染色体 isochromosome-iso 4、插入 insersion-ins 5、重复 duplication-dup 6、倒位 inversion-inv 7、双着丝粒染色体 dicentric chromosome-dic 8、环状染色体 ring chromosome r,缺 失,易 位,A B,A B,插入 inse

5、rtion-ins 重复 duplication-dup,A B,B A,倒位 inversion-inv,致突变作用的机制,引起突变的DNA变化 碱基损伤 1. 碱基错配 2. 平面大分子嵌入DNA链 3. 碱基类似物取代 4. 碱基的化学结构改变或破坏,致突变作用的机制（续）, DNA链损伤 二聚体的形成 (dimer) DNA加合物 (DNA adduct) DNA-蛋白质交联物 (DNA-protein crosslinks, DPC),碱基错配,碱基类似物取代,碱基化学结构改变,B(a)P-DNA加合物, 引起突变的细胞分裂过程的改变 1. 与微管蛋白二聚体结合； 2. 与微管上的巯

6、基结合； 3. 已组装好的微管的破坏； 4. 中心粒移动受阻； 5. 其他作用。 其他的改变 1DNA高保真复制受损； 2DNA修复受损。,DNA损伤类型 模式图,化学毒物致突变作用的结果,机体对致突变作用的影响, DNA损伤的修复 直接修复：光复活photoactivation “适应性”反应： O6-甲基鸟嘌呤- DNA甲基化转移酶（MGMT）, 切除修复 1、 核苷酸切除修复(nucleotide excision repair) 2、 碱基切除修复(base excision repair) 3、 错配修复 (mismatch repair) 4、 重组修复(recombination

7、-repair) 5、 非同源末端连接修复通路 （non-homologous end-joining pathway） 6、 呼救性修复（SOS repair）,机体对致突变作用的影响 (续),代谢酶遗传多态性 1氧化代谢酶：细胞色素P-450是机体代 谢化学毒物的主要酶类。 2酯酶：与致突变作用关系密切的是环氧 水化酶（EH） 3谷胱甘肽硫转移酶(GST)：它是体内重 要的解毒酶系之一，许多疏水性及亲电 子物质通过GST与谷胱甘肽结合形成硫 醚酸，经尿排除体外。,遗传因素对致突变作用的影响,参与化学物代谢的主要酶类,CYPs参与了90%以上化合物的代谢,修复功能的个体差异 1O6-甲基鸟嘌

8、呤-DNA-甲基转移酶（MGMT） 2聚（二磷酸腺苷-核糖）多聚酶（PARP） 是另一类参与DNA断裂修复酶。 3. 其它：DNA误配修复酶,观察化学毒物致突变作用的基本方法,观察项目的选择： 观察的遗传学终点： DNA完整性的改变(形成加合物, 断裂, 交联) DNA重排或交换 DNA碱基序列改变 染色体完整性改变 染色体分离改变, 成套的观察项目 体内、体外； 体细胞、生殖细胞； 代谢活化； 突变机制差异。,主要致突变试验所反映的遗传学终点 - 试验名称 DNA DNA重排 DNA碱基 染色体完整 染色体分离 完整性 或交换 序列改变 性改变 改变 - 细胞遗传学试验 1 2 微核试验 1

9、 2 显性致死试验 1 2 体外姐妹染色单体 交换试验(SCE) 2 1 可遗传易位试验 1 细菌回复突变试验 1 哺乳动物细胞突变试验 1 果蝇伴性隐性致死试验 1 转基因动物检测系统 1 DNA测序及分子杂交 检测技术 1 小鼠特定基因座突变试验 1 酵母重组试验 1 2 细菌DNA修复试验 1 体外UDS试验 1 单细胞凝胶电泳技术 1 DNA加合物检测技术 1 - 注：1和2分别代表主要和次要反映的终点。,成套项目选择原则： 1. 同时反映基因突变、染色体畸变、染色 体分离异常及原发性DNA损伤等各方面 的遗传学终点； 2. 物种：动物、细胞；原核生物、真核细 胞；细菌、动物细胞、人体

10、细胞 3. 体内、体外配合； 4. 体细胞、生殖细胞,常用的致突变实验 1. 细菌回复突变实验（Ames实验） 细菌回复突变实验是利用突变体的测试菌株，观察受试物能否纠正或补偿突变体所携带的突变改变，判断其致突变性。常用的菌株有鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌。 常用菌株：TA100、TA98、TA97、TA102,正向突变 野生型细菌(原养型) 突变型细菌(组氨酸缺陷型) 回复突变 Ames 试验原理示意图,Ames 试验常用测试菌株 菌株 突 变 检出突变 切除修复 R因子 脂多糖突变 TA1535 G46 置换 uvrB - rfa TA100 G46 置换+移码 uvrB pKM101 rfa

11、TA1537 C3076 移码 uvrB - rfa TA97 D6610 移码 uvrB pKM101 rfa TA1538 D3052 移码 uvrB - rfa TA98 D3052 移码 uvrB pKM101 rfa TA102 G428 置换+移码 + pKM101,pAQ1 rfa TA104 G428 置换+移码 uvrB pKM101,pAQ1 rfa ,2微核实验(micronucleus test, MN) 微核与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体。,3染色体畸变分析 (chromosome aberration analys

12、is) 将观察细胞停留在细胞分裂中期相，用显微镜检查染色体畸变和染色体分离异常。,4.姐妹染色单体交换实验(sister-chromatid exchange, SCE) 姐妹染色单体交换指染色体同源座位上DNA复制产物的相互交换，其频率与DNA断裂和修复有关。 5果蝇伴性隐性致死实验(sex-linked recessive lethal test, SLRL) 选择黑腹果蝇为实验动物，给予雄蝇受试物，如雄蝇的X染色体有突变，传给F1代雌蝇，再通过F1代雌蝇传给F2代雄蝇，使位于X染色体上的隐性基因在半合型雄蝇上表现出来。,6显性致死实验(dominant lethal test) 显性致死

13、实验是一种体内实验，用于检测整体哺乳动物生殖细胞遗传性损伤。显性致死突变指哺乳动物生殖细胞染色体发生结构和数目变化，出现受精卵在着床前死亡和胚胎早期死亡。 7程序DNA合成实验(unscheduled DNA synthesis) 当DNA 损伤时，即会发生S期半保留复制程序外的DNA合成，反映修复合成过程。,单细胞凝胶电泳 (Comet assay) 碱性彗星试验可检测DNA链断裂、碱性不稳定位点和不完全剪切修复位点的数量。,正向突变实验 常用基因座：HPRT、TK 检测碱基置换、缺失、移码和重排,致突变试验中的一些问题, 阴性和阳性对照的设立 体外试验的活化系统 哺乳动物细胞：如大鼠肝原代

14、细胞 S9：含混合功能氧化酶 纯化酶和基因工程,致突变试验与致癌试验的关系 大多致癌物具有致突变作用 非遗传毒性致癌物 长期致癌试验花费大，需要发展多种 短期试验用于致癌物筛检 结合动物实验、人群流行病学研究,试验结果在毒理学安全性评价中的作用 质量控制： 阴性和阳性对照 盲法原则 统计分析 结果重现性,阴性判定： 最高剂量：包括受试物溶解度或灌胃量许可的最大剂量; 组间差距：不应过大。 阳性判定： 剂量反应关系； 与阴性对照相比有显著差异。, 观察方法的新进展 （1） 转基因小鼠致突变检测系统： （2） 微核自动化检测技术： （3） 荧光原位杂交技术：,转基因超级鼠 1982年，英国的自然杂

15、志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生长激素重组基因导入到小鼠受精卵中,培育出具快速生长效应的“转基因超级鼠”。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大一倍。,转基因： 将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，称之为转基因技术。 转基因动物： 所谓转基因动物就是指以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。,Big Blue Rats 大蓝大鼠,Isolation of genomic DNA,Treatment,Mutant manifestation,Collection of tissues,Phage packaging or plasmid recovery,Infection of E. coli,Plating and plaque formation,Titer pl