河南科技大学大学生研究训练计划(SRTP)项目申请书-《RN.ppt

1、河科大大学生训练修订版(SRTP )，RNAi诱导tap mRNA分解对果蝇神经发育的影响，成员：乔钰峰夏南飞苏珂，这个项目工程的意义是什么？ 那项研究在生命学的研究中发挥着什么样的作用？ 原神经(proneural )基因发生，已知有确定神经祖细胞，神经祖细胞增殖分化后才形成神经系统，因此原神经基因在神经发生中起决定性作用。 原神经基因最初是从果蝇中发现的，后来被证明是bHLH基因。 此后人们在各种脊锥动物中发现了更多的bHLH基因，其neurogenin(ngn )基因就是其中之一，ngn直系果蝇同源蛋白Tap的功能迄今尚不清楚。 目前，ngn基因的课题组集中在ngn基因表达模式的检测上，

2、关注ngn突变体的制备及其突变表型的观察，但由于与ngn基因自身的调控和受控的反应历程不太相关，因此研究tap基因的功能和调控对ngn基因的相关研究具有重要意义1、创建一个tap基因克隆，调制相应的RNAi建构，PCR对5个元素进行放大，分别是(1)引物(2)铸造模型(3)mg2(4)taq多聚酶(5)4种dNTP，第1部分，然后在查找器上进行序列由于tap基因是bHLH模式基因，比较文献可以得到该模式的基因排列。 将得到的部分DNA序列放入primer3软件中得到该序列的引物，left primer5tcgatacgagcaatcac3right primer5atcttcaccacttgg

3、tgg 3，正方向， gactagtctcgatacgagcaatcacctgatcagctatcgtcgttagtg， atcttcaccacttggtgctagctagctagctagctagagagtgaccaccatcatcatcatcatccg gcagatctcgcactaacgacgagcatgagctaggaggttggtcaccaccacttcta tap knock down by RNAi，快速在空中，快速机器，RNAi Connery doublestrannery Transcription，Target gene，mRNA，Degradation，No transl

4、ation， third3333首先，在flybase的网站上，找到适合我们使用的vector(pWIZ vector )，上面有4个关酶催化剂点，分别是SpeI、AvrII、NheI 我们对这些个酶催化剂的酶催化剂切点(PWIZ vector图)、4种限制性酶催化剂序列、Spe Avr Nhe Xba、引物加酶催化剂切点和保护盐化学基后：应加引物设置修订2种：第一种： LP : gactagtctcgatacgaggaggaggaggagagagagaga 什么？ 什么？ 什么？ 什么？ 二是LP 3360 gctctagagctcgatacgagcaatcacrp 3360 ctagcta

5、gctagatctcacttggggtgg，第2部分.数字大板块果蝇DNA的提取和纯化，果蝇DNA的65度温度培育酚三氯甲烷异戊醇提取可以分离蛋白质和DNA，冷异丙醇使DNA沉淀，70个乙醇洗掉DNA表面残留的有机溶剂。酚三氯甲烷萃取法、组织萃取、组织匀浆、水相(DNA、RNA )、棉状沉淀(DNA、少量蛋白质、RNA )、DNA、消化缓冲液、酚三氯甲烷0.1mol/L NaCl、1% SDS (十二烷基磺酸纳金属钍)、10 mmol/ltr is-HCC 抑制、DNA酶活力、pH值适用于DNA游离到水相中，避免分解。 在、酚三氯甲烷(3:1、V:V) Tris-HCl饱和操作时，将移液器延伸

6、到试剂瓶底部，吸引下层试剂。酚和三氯甲烷都是表面改性剂，它可以有效除去水溶液中的蛋白质，使之改性沉淀。 三氯甲烷异戊醇(24:1，V:V )在用酚三氯甲烷试剂一次提取的水相中有残留的酚，由于酚和三氯甲烷相容，使用三氯甲烷二次变性馀留的蛋白质，可将酚带出云同步。 由于添加异戊醇可以降低分子表面张力，因此可以减少提取中气泡的产生。 异戊醇有助于云同步分相，离心后稳定维持上层水相、中层改性蛋白相及下层有机溶剂相，通过75%乙醇洗涤作用，除去其馀的金属络离子。 在云同步中，保护DNA的完全性，避免分解抑制核酸酶活性。 TE缓冲液TE缓冲液是Tris EDTA缓冲液，作为溶剂和保持剂使用，主要控制pH值

7、。 TE缓冲液为弱碱性，对DNA的盐化学基具有保护性。 DNA在TE提供的环境中稳定性好，不易破坏其完全性、开环或断裂。 包括提取的DNA，保存在TE缓冲液中。 实验材料新鲜存活的果蝇或20冻存1h的果蝇个体510个。 实验器材及器具：玻璃棒、烧杯、离心管、量筒、分析天平、水浴釜、台式高速离心机、4冰箱、长玻璃吸管、微进样器、枪头、紫外分析修订、琼脂糖凝胶电泳装置。 药品和试剂苯酚(Tris饱和苯酚)、三氯甲烷、异戊醇、十二烷基磺酸钠(SDS )、Tris盐化学基、乙亚胺四冰乙酸(EDTA )、异丙醇。 溶液配制：消化缓冲液：含有100mM的Nacl、10mM Tris.cl(PH8.0)、2

8、5mM的EDTA(PH8.0)、0.5的SDS。 含有TE缓冲液(ph8.0):10mmtris.cl(ph8.0)、1mM的EDTA(PH8.0)。 使阳离子电泳缓冲液TAE :阳离子电泳缓冲液(50tae):tris24.2g、冰冰乙酸5.7ml、0.25mol/L EDTA (pH8.0)20ml，向100ml中加入蒸馏水。 1TAE是制备阿胶里肌肉凝胶及其阳离子电泳的应用缓冲液。 0.7阿加里肌肉凝胶的制备：称阿加里肌肉凝胶0.28g，加入1tae40ml，用电炉加热至沸腾，等到凝胶冷却至50左右(用手试着加热)，加入3l GoldViewTW荧光染料，混合，在加入了梳子的制糨板中加入

9、糨糊，蒸发制冷后实验步骤1 )将6只麻醉果蝇(使乙醚挥发后进行漂亮地)放入离心管1.5ml中，加入30l消化缓冲液，用200 l tip枪头迅速捣碎。 2 )加入400l消化缓冲液，混合，每隔30分钟摇动65个热水浴，使样品被一盏茶消化。 3 )取出离心管，加入苯酚400l、三氯甲烷400l :异戊醇(24:1 )的混合物，拧紧管盖，上下反向充分混合，将提取的样品5ml、12000rpm离心5分钟。 4 )仔细吸取上清液，转移到新的离心管中。 加入异丙醇400l，轻轻混合3min后，可以看到白色丝团状物质的出现。 5 )以5)14000rpm离心10分钟，将丝团状物质沉入管底或管壁，小心注入液

10、体。 6 )用400l 75的乙醇清洗沉淀，以12000rpm离心5分钟，扔掉乙醇，反干燥至乙醇的味道消失，沉淀用50l TE缓冲液溶解。 (此时得到的白色丝状物为DNA. 7 )将完全溶解的DNA原液稀释1:100，即采集1l原液99l水，进行混炼。 取完全溶解的DNA原液，稀释1:100，即混合1l原液99l水。 紫外分光光度校正检查： A260=？ A280=？ 在DNA纯度检测、a260/a280、1.61.82.0、苯酚、蛋白质污染、纯度高的DNA、RNA污染、注意事项、组织提取早期进行精制时，要经常注意抑制核苷酸酶的污染，防止使用EDTA等进行DNA的分解。 剧烈的振动会破坏DNA

11、，所以请尽量柔软、缓慢地反复混合操作。 为了得到高纯度的DNA，加入蛋白酶k分解蛋白质。 DNA在260nm处有吸收峰，蛋白质在280nm处有吸收峰。 纯度比小于1.6时，可以考虑进行再精制。 整个实验要接触多种有毒、有腐食性的试剂，要注意操作规范的安全。Part3.PCR扩增及PCR产物的检测、纯化、铸造模型浓度应等于100ng/100 l引物浓度为0.1-0.5 mol/L TaqDNA多聚酶为0.5-2.5U/50 mol的4种dNTP的浓度，并放入PCR器中扩增，最后、PCR放大、PCR检测、凝胶调制2%凝胶100ml :将阿加莎里肌肉凝胶2g装入三角瓶中，加入0.5TBE (四溴乙烷

12、)液100ml，用微波炉加热2-5min，使阿加莎里肌肉凝胶完全溶解(注意不要突沸)，使阿加莎里肌肉凝胶完全溶解的取样和阳离子电泳器可以使用一般的稳定作用可调的中压阳离子电泳器，电泳液为0.5TBE液，接通电源，使样品从负极移动到正极。 60-100V的恒压阳离子电泳约为30-60分钟。 结果，将凝胶板放置在紫外透射器的灰水晶玻璃台上进行检查，DNA产物和荧光染料EB形成橙黄色荧光复合体。 观察各过程中是否出现橘红色荧光带，与放大时设置的阳性对照进行比较，判断阳性或阴性的结果。 也可以在阳离子电泳时以标准分子量进行对照，判断其扩展片断是否符合设定修订的大小。 为了用PCR纯化、纯化试剂盒纯化P

13、CR产物、Part4.重组质粒、选择质粒、建构RNAi重组质粒，选择含有多个特殊酶催化剂切点的质粒。 有红眼标记基因、酶催化剂切断质粒的脱磷酸化，为了防止自身结合、提高连接效率，切断单酶催化剂后，需要进行脱磷酸化。 去磷酸方法如下：1)在微量离心管中加入以下反应液，从50l:质粒DNA片段120 pmol 10 alkalinephosphatasebuffer5LCI AP (1030 u/l )2l无菌水定容至50l2。 3 )酚/三氯甲烷/异戊醇(25:24:1 )萃取2次，三氯甲烷/异戊醇(24:1 )萃取1次。 4)0.1倍体积的3M NaAc、2.5倍体积的冷乙醇酐、-20以下30

14、min-60min； 5)12000rpm离心10分钟，扔掉上清液，将沉淀用70%冷乙醇200l洗涤一次，晾干6)10l TE buffer溶解沉淀。 质粒和目的基因酶催化剂切割点的暴露反应体系：第1次： A:SpeI B:AvrII次： A:XheI B:XbaI反应条件：温度37、酶催化剂切割1.5h琼脂糖凝胶电泳检测酶催化剂切割结果紫外辐射投影仪观察结果UVP凝胶图像系统记录结果， 将质粒与目的基因连接的SpeI核酸内切酶、AvrII核酸内切酶、质粒放入试管1中，将SpeI核酸内切酶、AvrII核酸内切酶目的基因放入试管2中，在37截断1.5小时。 精制上述两管双酶催化剂切断物，用T4

15、DNA连接酶连接16夜。 同样，NheI核酸内切酶和XbaI核酸内切酶以同样的方式处理质粒和目的基因，连接酶催化剂剪接产物。 实验步骤：1、在无菌Eppendorf管中取载体50-100ng，加入一定比例的外来DNA分子(一般线性载体DNA分子和外来DNA分子的摩尔数为11-15 )，加入补充DNA分子摩尔数的溶液2 )轻轻搅拌，稍微离心，加入45水浴分3 )加入含有ATP的10Buffer 1l，T4 DNA连接酶的适当单位，用ddH2O补充10l。 2 .盖上箱盖，与一盏茶混合，将台式离心按钮放入离心秒钟。 3、第二天晚上的连接反应。 4 .反应结束后保存。 tips:1，链接器反应的温度

16、：链接器酶催化剂的最佳反应温度为，但在该温度下粘性末端的氢键不稳定，折衷选择了一个晚上。 重组质粒导入大肠菌群细胞球，外源DNA分子导入某一宿主细菌细胞球的过程经实验称为变形金刚(transformation )。 细菌处于易吸收外来DNA的状态，即受体状态时，最容易发生感受态。 常用的感受态方法是用CaCl2处理接纳体，使细菌细胞球处于敏感的受体状态。细菌在冻结(0)的CaCl2溶液中时，细菌细胞球膨胀为球形，感受态混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙元素磷酸复合体附着在细胞表面上，经过42小时的热冲击处理，促进细胞球吸收外来DNA。 在丰富的培养基中生长数小时后，球状细胞球恢复分裂增殖，被感受态的细菌中，运载体中的抗生素基因表达，可以在选择性培养基平板上选择所需的感受态子。 实验材料，1 )仪器和仪器恒温震荡器、分光光度校正、电沉淀离心机、涡混合器、恒温孵化机、电热恒温水