抗体的人工制备.ppt

1、章节安排，第1节多克隆抗体，第2节单克隆抗体，第3节基因工程抗体，第4节催化抗体，目的和要求1。掌握单克隆抗体和多克隆抗体的概念、制备原理和具体过程。2.了解基因工程抗体和催化抗体的概念和意义。难点和重点重点和难点：单克隆抗体和多克隆抗体的概念、制备原理和具体过程。为了研究抗体的理化性质、分子结构和功能，以及将抗体应用于临床疾病的诊断、治疗和预防，有必要人工制备抗体。目前，根据制备的原理和方法，它可分为四类：多克隆抗体、单克隆抗体、基因工程抗体、催化抗体和大多数天然抗原物质(如细菌或其分泌的外毒素和各种组织成分等)。)通常有许多不同的抗原决定簇，而每一个决定簇都能刺激机体产生特定的抗体。多克隆

2、抗体：多种抗原决定簇刺激机体后，由多种免疫淋巴细胞分泌的多种抗体的混合物。第1节多克隆抗体，1。概念2。多克隆抗体制备的基本过程，测定抗体滴度的血液试验，血清的分离和保存，多克隆抗体的纯化和标记的多克隆抗体的亲和层析，抗体的保存，缓冲体系，防腐剂，稳定剂，浓度，保存时间，(多头取样枪)排放枪，酶联免疫吸附试验板，96孔细胞培养板2。特征：抗体的重链、轻链及其V区独特型的特异性、亲和力、生物学特性和分子结构均相同。这种杂交瘤细胞不仅具有骨髓瘤细胞无限生长繁殖的特性，而且具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力。10:1，杂交瘤细胞通常用HAT选择性培养基筛选，培养基中加入次黄嘌呤(H)、氨基opte

3、rin (A)和胸腺嘧啶核苷(T)，用A阻断核酸的主要生物合成途径。代谢缺陷细胞系缺乏DNA合成所需的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷酸转移酶(HGPRT)，不能利用外源核苷酸前体，如H和T，失去了DNA合成的旁路途径。脱氧核糖核酸的合成只能通过以叶酸为介质从氨基酸和其他小分子化合物中合成核苷酸来进行。一旦叶酸衍生物的合成在HAT培养基中被A阻断，这些细胞就会死亡，因为它们失去了合成DNA的主要通道，无法从旁路合成DNA。在H和T的存在下，正常细胞可以通过旁路继续合成核酸。小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0是一种代谢缺陷细胞系，融合后不能在HAT培养基中生长，但融合细胞能在HAT培养基中存活，因为它们含有来自正

4、常细胞的HGPRT酶。在细胞中合成DNA一般有两种方法，主要的方法是在细胞中由糖和氨基酸合成核苷酸，然后合成DNA，而氨基蝶呤可以阻断这种方法。另一种辅助方法是在次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在下通过酶催化合成脱氧核糖核酸，但在骨髓瘤细胞的脱氧核糖核酸合成中没有这种辅助方法。在用HAT选择性培养的12天内，大量的肿瘤细胞将死亡，34天后，肿瘤细胞将消失，杂交细胞将形成小的集落。HAT选择性培养基维持710天后，应换成高温培养基，然后维持2周，再换成普通培养基。在选择性培养过程中，当杂交瘤细胞覆盖1/10的孔底时，可以检测特异性抗体并筛选出所需的杂交瘤细胞系。在选择性培养期间，通常每23天更换一半培养

5、基。单克隆抗体的制备过程：(1)天然抗原的制备；(2)免疫动物、免疫剂量和免疫次数的确定；(3)骨髓瘤细胞的制备；(4)从小鼠收集血液以测定抗体滴度；(5)小鼠脾细胞的制备和饲养细胞的制备；(6)小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞的融合；(7)阳性杂交瘤细胞的筛选；(8)抗体的筛选；(9)将阳性杂交瘤细胞腹腔注射到小鼠体内，并制备大量单克隆抗体。在细胞融合后的选择性培养过程中，由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡，此时单个或少数分散的杂交瘤细胞难以存活，通常必须加入其他活细胞进行繁殖，这就是所谓的饲养细胞。饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不清楚。一般认为，它们可以释放非物种特异性生长刺激因子，并为杂交瘤细胞

6、提供必要的生长条件。还可以满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中，小鼠腹腔巨噬细胞易于来源和制备，并能吞噬和清除死亡细胞及其碎片，因此它们是最常用的。饲养细胞时，细胞密度低不利于细胞生长和繁殖。小鼠腹腔细胞常被用作饲养细胞，也有清除死亡细胞的功能。饲养和存活一般不超过2周，并且不影响杂交瘤细胞的纯化。饲养细胞：腹腔巨噬细胞或脾细胞，免疫脾细胞-浆细胞，处于增殖状态的B细胞。浆细胞母细胞，也称为原生质细胞，是未成熟的浆细胞前体。浆细胞：处于终末分化阶段的能合成和分泌免疫球蛋白的B细胞。正常浆细胞存在于脾脏和淋巴结的相应组织中。B淋巴细胞的增

7、殖和分化：前B细胞，未成熟B细胞，成熟B细胞，膜免疫球蛋白，免疫球蛋白，IgD，骨髓：抗原刺激，浆细胞(免疫脾细胞)，浆细胞，存在时间短，2-3天，抗体分泌，记忆B细胞，膜免疫球蛋白的表达，存活识别抗原与高亲和力，抗原刺激，高亲和力，重视免疫学知识：1。免疫小鼠的年龄和性别：SPF Balb/c小鼠，612周龄，体重1822克，雌性(易操作)，分为3组，每组4只。2.免疫程序：一项豁免、两项豁免(15d)和三项豁免(29d)。3.免疫方式：体内免疫：免疫原性强、来源充足的抗原；体外免疫：免疫原性弱或对机体有害的抗原(如引起免疫抑制)。体外免疫：将脾细胞(或淋巴结细胞，或外周淋巴细胞)取出体外，

8、在一定条件下与抗原共培养，然后与骨髓瘤细胞融合。基本方法：将48周龄BALB小鼠脾脏制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤23次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原(可溶性抗原0.55微克/毫升，细胞抗原105106细胞/毫升)和一定量的BALB小鼠胸腺细胞培养上清液；在37.5% CO2中培养3-5天，然后分离脾细胞并与骨髓瘤细胞融合。4.免疫途径：最常用的是多点腹腔注射。常见的体内免疫方法包括皮下注射、腹腔注射或静脉注射，以及足垫、皮内注射、滴鼻或眼点注射。最后一次免疫通常采用腹腔注射或静脉注射，目前特别推荐后者。5、免疫佐剂：首次免疫，弗氏完全佐剂(油包水混浊液，含有与分枝

9、杆菌结合的细胞壁成分)；等量的两种豁免，三种豁免，弗氏不完全佐剂(不包括结合的分枝杆菌)。等量，注意免疫学知识：腹腔注射，3。优点(1)制备过程中无需纯化抗原即可获得纯抗体；(2)它具有高效力，(3)它具有高均匀性和均匀性；(4)高产、连续生产。5.单克隆抗体的应用(1)诊断试剂：用于各种病原体和肿瘤的诊断。避免多克隆抗体的交叉反应(2)治疗试剂：兽医临床治疗传染病；它可以抑制器官移植排斥反应，治疗自身免疫性疾病，并在医学临床上制备生物导弹。(3)检测试剂：检测各种病原体的毒力因子；检测各种免疫细胞和其他组织中的细胞表面分子。(4)抗原纯化：利用单克隆抗体的特异性，将单克隆抗体与琼脂糖偶联制成

10、亲和层析柱，从混合组分中提取部分抗原组分。为了制备疫苗，“生物导弹”是免疫导向药物的形象名称，它是由单克隆抗体和药物、酶或放射性同位素结合而成的。由于单克隆抗体的存在，它可以自动导向，与生物体中特定的靶细胞或组织结合，并通过其携带的药物产生治疗效果。自1975年单克隆抗体杂交瘤技术问世以来，单克隆抗体已广泛应用于医学疾病的诊断和治疗。然而，目前绝大多数单克隆抗体都是鼠源性的，而抗鼠抗体是在重复临床给药时在体内产生的，这削弱或消失了临床疗效。因此，医学临床上理想的单克隆抗体应该是人，但人-人杂交瘤技术尚未突破。在第三部分，基因工程抗体，目前更好的解决方案是开发基因工程抗体来代替小鼠单克隆抗体用于

11、临床。基因工程抗体出现于20世纪80年代初，是一种新型抗体，也称为第三代抗体，它是通过在分子水平上切割、剪接或修饰抗体基因，或将其引入受体细胞进行人工合成后表达而产生的。成功的基因工程抗体包括嵌合抗体、重组抗体和小分子抗体。1.概念，通过基因工程技术制备抗体分子。根据人类设计重组的新抗体分子可以保留或增加天然抗体的特异性和主要生物活性，去除或减少不相关的结构(如Fc片段)，从而克服了单克隆抗体在临床应用中的缺陷(如在人体内使用鼠源性单克隆抗体会导致抗体产生并降低其作用，以及Fc片段的无效性和副作用)，具有广阔的应用前景。嵌合抗体是指同一抗体分子中含有不同物种抗体片段的抗体，也称为杂交抗体。抗体

12、重建：将小鼠抗体的高变区基因嵌入人抗体Fab骨架区的编码基因，然后将该DNA片段与人免疫球蛋白恒定区基因连接，然后转染杂交瘤细胞表达嵌合V区抗体。单链抗体又称Fv分子，由VL区的氨基酸序列和由肽链连接的VH区的氨基酸序列组成。噬菌体抗体：一种基因工程抗体，与抗体可变区基因和编码噬菌体外壳蛋白的基因融合。催化抗体，又称抗体酶，是一种具有催化活性的免疫球蛋白，它既具有抗体的高选择性，又具有酶的高催化活性。1.催化抗体的概念。催化抗体，又称抗体酶，是一种具有催化活性的免疫球蛋白，它既具有抗体的高选择性，又具有酶的高催化活性。抗体制备技术的发展表明，人工生产适用于各种目的的高效催化剂是可能的，特别是自

13、然界中不存在的催化剂，这对于生物学、化学和医学等许多学科都具有重要的理论意义和实用价值。(2)催化抗体的制备目前，催化抗体的制备采用化学和免疫相结合的方法。首先模拟酶作用于底物的过渡态结构，化学合成相应的类似物半抗原免疫动物，然后用单克隆技术筛选获得单克隆抗体。催化抗体的研究开辟了人工酶设计的新途径，为寻找新型、高效、高选择性的催化剂创造了条件。1.细胞融合法首先通过化学反应合成反应物的过渡类似物(通常为半抗原)，然后与载体蛋白偶联，制备抗原免疫BALBc小鼠。b细胞hy单克隆抗体和反应物在过渡态的结合降低了反应的活化能，从而加速了反应。抗体结合位点的化学修饰抗体酶可以像酶一样通过化学修饰进行修饰。抗体酶结构修饰的关键是找到一种温和