HLA-B27检测.ppt

1、PCR-SSP检测HLA-B27，另一方面，实验目的是掌握HLA基因分离的原理，学习PCR-SSP基因分离方法。 二、实验原理上查询密码HLA的基因具有高度多态性，其在每一个基因座中有多个复等位基因，每一个等位基因有各自的DNA序列，因此可通过对应的序列专一性引物(SSP )扩增。 通过控制PCR反应条件，特异性引物只放大相应等位基因，而不放大其它等位基因。实验步骤、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、提取DNA、PCR扩增的基本原理、铸造模型DNA的改性(热致变性)通过铸造模型DNA双链或PCR扩增引起的双链DNA解离铸造模型DNA与施主的退火(恢复性) :铸造模型DNA加热变性成为单链后引物的延长

2、： DNA铸造模型引物结合物在TaqDNA多聚酶的作用下，以dNTP为反应原料，以靶序列为铸造模型，以碱基对和半保留复制原理，合成与铸造模型DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性退火延长三个过程， 可在23小时内等待的PCR扩增体系、十大板块DNA上游引物dNTP (原料)缓冲体系(各种络离子和水)耐热的DNA多聚酶、 polymorphisminthemhcvariation1% atasinglegeneticlocusinapopulationofindividualseachpolymorphicvariantiscalledanalleleinthehe pool 200 mhca

3、lleleshavebeenidentified.mhcgenesarethemostpolymorphicknown，polymorphicresiduesarelocatedintheantigen -绑定groovev schematicdiagramofclassiandclassimhcgenes、mrna转录、and protein molecules、everyhlaallelehasitsownuniquesequennes规范isdesignedtobindtotheallelicsequencescomplementarily是sequencespecificprimeri

4、susedtotypehlaallelewithpcr、sequencespecificpricprily 三、实验材料和方法1、血液样品： 0.2 ml EDTA抗凝血血2、血红细胞分解液3、白细胞分解液4、PCR混合液pcrbufferhla-b 27 ssptaqdntpinternalpositivereferenceprimers。 2 .离心4000rpm2min； 3 .重复2次步骤12，最后将用棉棒吸引管壁液体的4.100ul的WBC裂解液取入所述WBC管中进行混炼5 .将WBC管在60oC水浴中消化20min.取出WBC管100oC、3-5min、蛋白质7 .离心10000rpm2min。 上清是富含DNA的PCR数字大板块。 二、PCR放大1、吸引2ul铸造模型DNA放入装有PCR混合液的小管(留心不放入石蜡油层)2.将小管放入PCR器内进行放大。 (需要80min )、12、23、预改性： 94 oC 2min改性： 94 oC 12sec恢复性： 62min扩张： 72 30sec扩张： 94 oC 12sec恢复性： 58 oC 50sec扩张： 72oc将琼脂糖凝胶板放置在阳离子电泳槽内取出四、结果观察、specificbands