几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶.ppt

1、Enzymes for Molecular Cloning,酶,几乎所有的生物都能合成自身所需要的酶，包括许多病毒。 酶参与所有生命活动过程，其在细胞内的分布、含量、活性等随生物生长、发育及外界条件的改变而改变。 Ribozyme：具有催化能力的RNA。酶不都是蛋白质。 定义：由活细胞产生，能在体外和体内起同样催化的一类具有特殊空间结构的生物大分子，包括蛋白质和核酸等。,用于基因克隆的酶,ER 连接酶 DNA聚合酶:Klenow酶、Taq酶、反转录酶、 末端转移酶 碱性磷酸酶 多核苷酸激酶 核酸酶,RE,如果在细菌中没有发现ER，现代生物学和重组DNA就不可能发展起来。,Restriction

2、 Endonuclease definition:molecular knives Hundreds known, commercially available. function: R-M defense mechanism against foreign DNA. prevent invasion by foreign DNA such as viral DNA,by cutting it up. 修饰酶又称甲基化酶。,三大类 I：最早发现 3个亚基： HsdS识别特定DNA序列 HsdM-甲基化 HsdR-限制性内切酶功能 三个亚基组成复合体，全酶才有活性。 biochemistry：n

3、eed ATP,Mg+,SAM cutting：long sequences(1000-5000nt),at random unspecial,cant be used in genetic engineering,III： 2个亚基组成： HsdM、 HsdR 需要SAM、ATP、Mg2+ 类似于I 应用同样受限制,II: 应用最广 酶最简单(Mg2+) 不需要特殊条件 HsdM 和 HsdR亚单位 切割特异,derivation： first three names from the latin names of the microorganism that produces them.

4、first letter(genus),next two letters(species) writing：前三个字母用斜体，其他用正体表示。 如果酶存在于一种特殊菌株中，三个字母后加上菌株名称符号,名称最后部分往往包含罗马数字,表示在该特殊菌株中发现这种酶的先后次序。,recognition sequence: cleave DNA symmetrically in both strands at short palindromic (symmetrical) recognition sequences to leave a 5-phosphate and a 3-OH. They leav

5、e blunt ends,or protruding 5- or 3-termini. EcoR: * 5G A A T T C 3 3C T T A A G 5 * ,recognition sequence enzymes 5 GTT AAC 3 Hpa blunt end 3 CAATTG 5 5 GAATTC 3 EcoR 5protruding end 3 CTTAAG 5 5 AAGCTT 3 Hind 5protruding end 3 TTCGAA 5 5 GGATCC 3 BamH 5protruding end 3 CCTAGG 5 5 CTGCAG 3 Pst 3prot

6、ruding end 3 GACGTC 5,估算ER识别序列在DNA上出现的频率: 识别序列的频率=1/4N Sau3A(4bp)=1/4 4 256bp EcoRI、PstI(6bp)=1/46 4096 NotI(8bp)= 1/48 65536 (rare cutters) 仅是理论推测,Restriction digests digestion of plasmid or genomic DNA,for analytical or preparative purposes, using commercial enzymes and buffer solutions. All RE re

7、quire Mg2+,usually at a concentration of up to 10mM,but different enzymes require different pHs,NaCl concentrations or other solution constituents for optimum activity.,同裂酶(isoschizomer)或异源同工酶:不同来源的限制酶可切割同一靶序列 同尾酶(isocaudiners)：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。 远距离裂解酶(distant cleavage)：识别位点与切割位置不一致 可变酶：识别序列中

8、的一个或几个核苷酸是可变的 Subset酶：一种酶的识别序列包含于另一些酶的识别序列之中,enzymes activity,1个活性单位：在适当的反应条件下(包括温度、pH和离子强度等),1h 内在50l容积中完全酶解1ug特定DNA底物(通常用DNA)所需要的酶量。,星号活力,在非标准反应条件下,也能切割一些与其特异识别序列类似的序列。在酶的名称右上角加一个星号(*)表示,如EcoR*。 因此,只有在相当特殊的条件下,酶活才与发表的结果相符。 必须采用规范的实验步骤,坚持应用推荐的反应条件。,底物位点优势效应,酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同,Applications 透析

9、到含50甘油的贮藏缓冲液,保存在-20。 消化DNA时,稀释到1-3单位/l。 反应缓冲液可在有关书籍中查找到。,酶切反应注意事项 价格昂贵 决不能用水稀释,以免变性失活。 预先加入除酶以外的所有其他试剂。 取酶立即放于冰上。分装小份避免反复冻融。 使用无菌的新吸头。 少加水,使体积最小,但保证酶液体积不超过总体积的10,否则酶液中的甘油会抑制酶活性。,restriction map DNA physical map：a series of ER Demonstration:Linear or circle application： DNA sequencing, genome functio

10、n map, gene library construction, RFLP Methods：virous ER，single or double digestion, fragments size,DNA Ligase 定义：催化DNA上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的3羟基和5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键，使断开的DNA裂口连接起来。 用途：具有修复单链或双链的能力,在DNA重组、复制和损伤后的修复中都起关键作用。 提取：许多原核和真核生物及病毒中。,T4 DNA ligase 一条多肽链(Mr=68000)，还可作用于 RNA,但效率低得多,需ATP作辅因子。,E.coli DNA li

11、gase Mr=74000, 作用于5端带磷酸基团的DNA底物 NAD+可促进该催化反应 分子克隆使用不多，亦不能连接RNA。 用途: cDNA第二链合成。,T4 RNA ligase 由噬菌体编码 催化单链DNA或RNA连接。 主要用途是对RNA进行3末端标记,Ligation of DNA fragments in vivo and in vitro in vivo：不仅形成重组分子的效率低,而且还可能伴随着末端核苷酸的缺失。 in vitro： 减小了DNA进入细胞后遭受降解危险； 粘性末端体外连接将保护原来识别序列的完整 可以控制连接时的反应条件,affecting factors T

12、：多数内切酶产生的粘性末端的Tm值在15以下,然而保持连接酶活性的最适温度却是37, 因此最适温度是粘性末端的Tm值和连接酶最适温度的折衷。经常采用12.5（4-15）。 DNA concentrations：外源片段浓度比载体DNA浓度高10-20倍 防止环化：碱性磷酸酶预先处理质粒载体 time：O/N better,polymerase 催化核酸体外合成反应,DNA polymerase 依赖于DNA的DNA聚合酶: DNA聚合酶(全酶); DNA聚合酶大片段 (klenow片段); 耐热DNA聚合酶 (Taq 酶) 依赖于RNA的DNA聚合酶:反转录酶。 不依赖于DNA的DNA聚合酶:

13、末端转移酶。,RNA polymerase 催化RNA体外合成反应 依赖DNA的RNA聚合酶 不依赖DNA的RNA聚合酶,nuclease 以核酸为底物的水解酶 按底物专一性分：RNase、DNase、非专一性核酸酶 按作用位点分：内切或外切酶 5-核酸酶或3-核酸酶 常用:BAL31核酸酶、S1核酸酶、绿豆核酸酶、RNaseA RNaseT1、DNase、外切核酸酶、噬菌体 外切核酸酶等。 许多核酸酶兼有内切和外切活性,核酸酶的分类 内切酶 非专一性 外切酶 3-核酸酶 核酸酶 内切酶 5-核酸酶 RNA 外切酶 专一性 非限制性 内切酶 限制性 DNA 外切酶,Kinase 激酶:对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 用途： 放射性标记DNA链的5末端，探针标记 Maxam-Gilbert化学法的DNA序列分析；使缺少5磷酸的DNA片段和合成接头磷酸化。 该酶很难纯化,酶制品经常不纯。 铵离子是该