微生物的生长.ppt

1、第 七 章 微生物的生长,生长微生物细胞吸收营养物质，进行新陈代谢，当同化作用异化作用时，生命个体的重量和体积不断增大的过程。 繁殖生命个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。 发育从生长到繁殖，是生物的构造和机能从简单到复杂、 从量变到质变的发展变化过程，这一过程称为发育。 个体生长微生物细胞个体吸收营养物质，进行新陈代谢，原生质与细胞组分的增加为个体生长。 群体生长群体中个体数目的增加。可以用重量、体积、密度或浓度来衡量。（由于微生物的个体极小，所以常用群体生长来反映个体生长的状况）个体生长个体繁殖 群体生长 群体生长 = 个体生长 + 个体繁

2、殖,生长与繁殖的概念,第七章 微生物的生长与控制,第一节 微生物纯培养分离及生长测定 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 微生物生长繁殖的控制,第一节 微生物纯培养分离及生长测定,一、获得纯培养的方法,纯培养(pure culture)微生物学中把在实验室条件下从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养. 单细胞：细菌、酵母菌等 多细胞：丝状真菌,首先将待分离的样品进行连续稀释,目的是得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物.如果经过稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是由一个微生物个体繁殖而来

3、的纯培养物. 这种方法适合于细胞较大的微生物.,液体稀释法,平板划线分离法（Streak Plate）,特点：快速、方便。 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）,An inoculating loop is used to thin out organisms on the surface of the agar.,连续划线（左图）,划线分离后平板上显示的菌落照片（右图）,倾注平板法（Pour Plate）,Organisms are serially diluted, then a small amount is added to an empty steril

4、e petri dish, to which melted agar at 50 C is added. Then mix to distribute the organisms.,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,9ml,9ml,9ml,9ml,Pour plate,Pour plate,Pour plate,Pour plate,平板涂布分离法（Spread Plate）,简单易行，但易造成机械损伤,Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.,选择性

5、培养分离法,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离 富集培养,单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养的方法。该方法要在显微镜下进行。 毛细管法：用毛细管提取微生物个体，适合于较大微生物。 显微操作仪：用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子以获得纯培养。 小液滴法：将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,二、微生物纯培养生长的测定方法,描述不同种类、不同生长状态的微生物生长情况，需

6、选用不同的测定指标。 （一）微生物细胞数目的检测法 直接法（血球计数板、比例计数法） 间接法（活菌计数法、液体稀释法、膜过滤法） （二）微生物生长量和生理指标测定法 直接法(干重法，堆体积法) 间接法（比浊法，碳、氮含量法，其它生理指标）,1.血球计数板法,原理：将1cm20.1mm的薄层空间划分为400小格，从中均匀分布地选取80或100小格，计数其中的细胞数目，换算成单位体积中的细胞数。 适用范围：个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不适用于细菌等个体较小的细胞，因为（1）细菌细胞太小，不易沉降；（2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 特点：快速，准确，对酵母菌可同时测定出芽率，

7、或在菌悬液中加入少量美蓝可以区分死活细胞。,血球计数板法原理,2.涂片染色法,应用：可同时计数不同微生物的菌数，适 于土壤、牛奶中细菌计数。 方法：用镜台测微尺计算出视野面积；取 0.1ml菌液涂于1cm2面积上，计数后代 入公式： 每ml原菌液含菌数 =视野中平均菌数涂布面积/视野面积 100 稀释倍数,3.平板菌落计数法,平板菌落计数法技术要求,技术要求：样品充分混匀，操作熟练快速（1520min完成操作），严格无菌操作； 注意事项：每一支吸管只能用于一个稀释度，样品混匀处理，倾注平板时的培养基温度； 适用范围：中温、好氧和兼性厌氧、能在营养琼脂上生长的微生物， 误差：多次稀释造成的误差是

8、主要来源，其次还有由于样品内菌体分布不均匀、以及不当操作,A standard plate count (viable count) reflects the number of viable microbes and assumes that each bacterium grows into a single colony; plate counts are reported as number of colony-forming units (CFU) per ml (CFU/ml) or per g (CFU/g) of sample.,When we observe colonies

9、, we cannot assume each arose from just one cell originally planted on the medium, however. A pair, chain or cluster of cells which land on the medium in close proximity to each other can multiply and produce a single colony. Thus, we use the term colony-forming unit when we consider the common orig

10、in for the cells of any colony. This term is usually abbreviated CFU.,Colony-Forming Unit,4.液体稀释法,10n,10n-2,10n-1,5.薄膜过滤计数法,常用该法测定含菌量较少的空气和水中的微生物数目。 将定量的样品通过薄膜（硝化纤维素薄膜、醋酸纤维薄膜）过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,6.干重法,将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来,然后烘干(干燥温度可采用105、100或80)、称重。一般干重为湿重的10%20%，而一个细菌细胞一般重约1

11、0-1210-13g。 该法适合菌浓较高的样品。 举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10121013g，液体培养物中细胞浓度达到2109个/ml时，100ml培养物可得1090mg干重的细胞。,7.比浊法,原理是在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，借助于分光光度计，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反应出菌液的浓度。,特点：快速、简便；但易受干扰。,8.生理指标法,测含氮量 蛋白质是细胞的主要物质，含量稳定，而氮是蛋白质的主要成分，通过测含氮量就可推知微生物的浓度。 一般细菌含氮量为干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.0%，根据

12、一定体积培养液中的含氮量再乘以6.25，就可测得粗蛋白的含量。 其他方法 含碳、磷、DNA、RNA、耗氧量、消耗底物量、产二氧化碳、产酸、产热、粘度等，都可用于生长量的测定。,Table 1. Some Methods used to measure bacterial growth,第二节 微生物的生长规律,一、微生物的个体生长和同步生长,由于微生物细胞极其微小，研究其个体生长存在着技术上的困难。 同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长（synchronous growth） ，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。 同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的

13、同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料,获得同步生长的方法,获得同步生长的方法主要有两类： 环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等。造成与正常细胞周期不同的周期变化。 选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,Helmstetter-Cummings 法,原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。 步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,Figure 5. The synchronous growth

14、of a bacterial population. By careful selection of cells that have just divided, a bacterial population can be synchronized in the bacterial cell division cycle. Synchrony can be maintained for only a few generations.,Figure .synchronous growth,二、微生物的群体生长,无分支单细胞微生物主要包括细菌和酵母菌，其群体生长 是以群体中细胞数量的增加来表示的。

15、由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时（eneration time, G ），代时也就是群体细胞数目扩大一倍所需 时间，有时也称为倍增时间。,右图表示的是一个细胞经过若干代分裂后的情况。右图可见，每经过一个代时，细胞数目就增加一倍，呈指数增加，因而被称为指数生长，这就是单细胞群体生长的特征。,1.无分支单细胞微生物的群体生长特征,By definition, bacterial growth is cell replication i.e., growth of the culture. Most species of bacteria replicate

16、by binary fission, where one cell divides into 2 cells, the 2 cells into 4, the 4 into 8, etc. If this cell division occurs at a steady rate such as when the cells have adequate nutrients and compatible growing conditions we can plot numbers of cells vs. time such as on the graph at right. Before to

17、o long, we will need to extend the paper vertically as the population continues to double. For a culture where cells divide every 20 minutes, one cell can result in 16,777,216 (i.e., 224) cells after just 8 hours barring nutrient depletion or other growth-altering conditions.,1.无分支单细胞微生物的群体生长特征,If w

18、e were to convert our vertical axis to a logarithmic scale as on the graph at right we will not need as many sheets of graph paper, and we will find that a steady rate of growth is reflected as a straight line. (On the vertical axis, the same distance on the paper is covered with each doubling.) Thi

19、s type of graph paper is called semilogarithmic graph paper on which we will be plotting our class results. The numbers we plot will fall on the graph at the same place the logarithms of these numbers would fall when plotted on conventional graph paper.,The example at right shows the type of graph w

20、e may obtain from our class data. We can plot both colony-forming units (CFUs) per ml and absorbance on the same graph, remembering that the absorbance units should also be on a logarithmic scale. Rather than connecting the dots, we draw the best straight line among our CFU/ml plots to represent the

21、 phases of growth lag, exponential, and the start of the maximum stationary phase.,指数生长可以用下式表示： b = B2n B, b 和 t 可由试验获得， n 可通过上式计算得出，将等式两侧取对数重排后得： lgb = lgB + nlg2 lgb - lgB lgb - lgB lg2 0.301,式中： B 为起始师细胞数目， b 为指数生长某个时刻 t 时的细胞数目， n 为世代数,=,指数生长,n =,例如：一培养液中微生物数目由开始的12，000（ B ），经4h （ t ）后增加到49，000，0

22、00（ b ）， 这样， n (lg4.9107lg1.2104）0.30112,借助于 n 和 t ，还可以计算出不同培养条件下的代时G， G t / n 在本例中， G 460 / 12 20min 该种微生物的代时为20分钟。在4小时内共繁殖了12代。,代时能够反应细菌的生长速率，代时短，生长速率快，代时长，生长速率慢。在很多微生物学研究中常常要了解微生物的代时。 代时在不同种微生物中的变化很大，多数微生物的代时为13h,然而有些快速生长的微生物的代时还不到10min,而另一些微生物的代时却可长达几小时或几天；另外，同一种微生物，在不同的生长条件下其代时的长短也不同；但是，在一定条件下，

23、每一种微生物的代时是恒定的，因此它是微生物菌种的一个重要特征。,一些细菌的代时,Table . Generation times for some common bacteria under optimal conditions of growth.,不同温度下的代时,G (generation time) = t(time, in minutes or hours)/n(number of generations) G = t/n G = generation time (time for the cells to divide) t = time interval in hours or

24、minutes B = number of bacteria at the beginning of a time interval b = number of bacteria at the end of the time interval n = number of generations (number of times the cell population doubles during the time interval) b = B x 2n (This equation is an expression of growth by binary fission) G = t/n,S

25、olve for n: n = logB + nlog2 n = logb - logB log2 n = logb - logB .301 n = 3.3 logb/B G = t/n Solve for G G = t 3.3 log b/B,Calculation of Generation Time,Example: What is the generation time of a bacterial population that increases from 10,000 cells to 10,000,000 cells in four hours of growth?,G =t

26、 3.3 log b/B G = 240 minutes 3.3 log 107/104 G = 240 minutes 3.3 x 3 G = 24 minutes,2.无分支单细胞微生物的群体生长曲线,以细菌为例介绍无分支单细胞微生物群体生长规律，其结论也基本适用于酵母菌。 生长曲线代表了细菌在新的环境中从开始生长、分裂直至死亡的整个动态变化过程。 每种细菌都有各自的典型生长曲线，但它们的生长过程却有着共同的规律性。一般可以将生长曲线划分为四个时期。,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌增长数

27、目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,生长曲线的制作,典型的生长曲线 （Growth curve）,延滞期,对数期,稳定期,衰亡期,时期的划分：按照生长速率常数（growth race constant）不同,一条典型的生长曲线至少可以分为迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。,.,其它名称：停滞期、调整期、适应期 1.现象：活菌数没增加，曲线平行于横轴。 2.特点： 生长速率常数= 0 细胞形态变大或增长 细胞内RNA特别是rRNA含量增高，原生质嗜碱性增强 合成代谢活跃（核糖体、酶类、ATP合成加快），易产生诱导酶 对外界不良条件敏感，（如氯化钠浓度、温度、抗生素等化学药物） 3.原

28、因：适应新的环境条件，合成新的酶，积累必要的中间产物,延滞期（lag phase）,菌种 ： 繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短； 接种物菌龄 ： 用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期； 接种量：一般来说， 接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）； 培养基成分： 在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素,认识延迟期的特点及形成原因对实践的指导意义,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期 采取的缩短lag

29、 phase 的措施有： 增加接种量； （群体优势-适应性增强） 采用对数生长期的健壮菌种； 调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。 选用繁殖快的菌种 在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,对数期（logarithmic phase）,其他名称：指数期 现象：细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。 特点： 生长速率常数最大，即代时最短 细胞进行平衡生长，菌体大小、形态、生理特征等比较一致 代谢最旺盛 细胞对理化因素较敏感 影响因素： 菌种 营养成分 营养物浓度 培养温度,应用意义 由于此时期的菌种比较健壮，增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄； 发酵工业上

30、尽量延长该期，以达到较高的菌体密度 食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察等的良好材料。,营养物浓度与对数期生长速率和产量,作用方式：影响微生物的生长速率和总生长量 生长限制因子：凡是处于较低浓度范围内，可影响生长速率和菌体产量的营养物就称生长限制因子,细胞数或菌体量, 稳定期（stationary phase）,又称：恒定期或最高生长期 特点：新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，微生物的生长速率处于动态平衡，培养物中的细胞数目达到最高值。 细胞分裂速度下降，开始积累内含物，产芽孢的细菌开始产芽孢。 此时期的微生物开始合成次生代谢产物，对于发酵生产

31、来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。 产生原因： 营养物尤其是生长限制因子的耗尽 营养物的比例失调，如碳氮比不合适; 有害代谢废物的积累（酸、醇、毒素等） 物化条件（pH、氧化还原势等）不合适;,应用意义： 1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下： 补充营养物质（补料） 调pH 调整温度 2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。,生长产量常数（Y，或生长得率，growth yield）： 概念：表示微生物对基质利用效率的高低 Y=菌体干重/ 消耗营养物质的浓度 根据产量常数可确定微生物对营养物质的需要量 如：Y=0.5，表

32、示要得到5g菌体，需某营养物（葡萄 糖）10g。, 衰亡期（decline phase）,特点 细胞死亡数增加，死亡数大大超过新增殖的细胞数，群体中的活菌数目急剧下降，出现“负生长”。 细胞内颗粒更明显，细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。 因菌体本身产生的酶及代谢产物的作用，使菌体死亡、自溶等，发生自溶的菌生长曲线表现为向下跌落的趋势。 衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。 产生原因 生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡,3.微生物生长与代谢产物形成的关系,微生物发酵形成产物的过程与微生物细胞生长的过程并不总是一致的。一般

33、认为：,初级代谢是给予生物能量和生成中间产物的过程，初级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程同步，微生物生长的稳定期是这些产物的最佳收获时机；,次级代谢产物与微生物的生存、生长和繁殖无关。次级代谢产物的形成往往与微生物细胞的形成过程不同步。在分批培养中，它们的形成高峰往往在微生物生长稳定期的后期或衰亡期。,4.丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,可分为三个阶段： 1、生长停滞期 2、迅速生长期 3、衰退期,1

34、、生长停滞期: 造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。 2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。 3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,丝状微生物的群体生长分期,连续培养（continuous culture）,分批培养（batch culture） ：将微生物置于一

35、定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。 连续培养（continuous culture） ：在微生物培养的过程中，不断地供给新鲜的营养物质，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期，以利于微生物的增殖速度和代谢活性处于某种稳定状态。 连续培养理论基础：由于对典型生长曲线中稳定期到来原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出现在的连续培养技术。,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的

36、平衡生长状态和稳定的生长速率。,连续培养原理,按控制方式分 按培养器的级数分 按细胞状态分 按用途分,内控制（控制菌体密度）：恒浊器 外控制（控制培养液流速、以控制生长速率）：恒化器,单级连续培养器 多级连续培养器,一般连续培养器 固定化细胞连续培养器,实验室科研用：连续培养器 发酵生产用：连续发酵罐,连续培养器,连续培养技术恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的

37、亚适量，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。 应用范围：实验室科学研究,Figure . Schematic diagram of a chemostat, a device for the continuous culture of bacteria. The chemostat relieves the environmental conditions that restrict growth by continuously supplying nutrients to cells and removing waste substances an

38、d spent cells from the culture medium.,恒化器Chemostat 或bactogen,概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。 原理：通过调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来维持菌浓度不变,即浊度不变。主要采用恒浊器，当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。 特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长，并可在允许范围内控制不同的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。,连续培养技术恒浊培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,恒浊器与恒化器的比较,连续发酵（cont

39、inuous fermentation）,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。 优点： 高效，简化了操作装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等单元操作； 自控：便于利用各种仪表进行自动控制； 产品质量稳定 节约大量动力、人力、水和蒸汽，且使水、汽、电的负荷均衡合理。 缺点：菌种易于退化；易于遭到杂菌污染；营养物利用率低于单批培养。 连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,微生物与所处的环境之间具有复杂的相互影响和相互作用:一方面,各种各样的环境因素对微生物的生长和繁殖有影响,另一方面,微生物生长繁殖也会影响和改变环境.研究环境因素与微生物之间的关系,可以通过控制环境条件来利

40、用微生物有益的一面,同时防止它有害的一面.,第三节 影响微生物生长的主要因素,影响微生物生长的外界因素很多，除了前面讲过的营养因素之外，还有许多物理化学条件。 本节主要内容： 一、温度对微生物生长的影响 二、氧气对微生物生长的影响 三、pH值对微生物生长的影响,几个基本概念,灭菌（sterilization） 采用强烈的理化因素是任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。 消毒（disinfection） 采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原菌，而对被处理物体基本无害的措施，称为消毒。 防腐（antisepsis） 利用理化因素完全抑制霉腐

41、微生物的生长繁殖，从而达到防止物品发生霉腐的措施，称为防腐。 化疗（chemotheraphy） 即化学治疗。利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的生长繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。,低温 利用4以下的各种低温以保藏食物、药品、菌种等。 缺氧 在密闭容器中加入除氧剂，如铁粉。真空保藏也是比较常用的方法。 干燥 采用晒干或红外线干燥保藏粮食、食品等，或在密封条件下用吸湿剂也可达到防霉作用。 高渗：通过盐渍或糖渍达到高渗。 高酸度：如泡菜、酸菜等。 防腐剂：苯甲酸、山梨酸、脱氢醋酸等,防腐的措施,温度是影响微生物生长的最重要因素之一。 温度对微生物的影响具体表现在： 影响酶活

42、性，温度变化影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。 影响细胞膜的流动性，温度高，流动性大，有利于物质的运输，温度低，流动性降低，不利于物质运输，因此，温度变化影响营养物质的吸收与代谢产物的分泌。 影响物质的溶解度，对生长有影响。,一、温度对微生物生长的影响,从微生物整体来看 生长的温度范围一般在-10 100 极端下限为-30 ，极端上限为105300 但对于特定的某一种微生物： 只能在一定温度范围内生长，在这个范围内，每种微生物都有自己的生长温度三基点，即最低、最适、最高生长温度,超过最低生长温度时，微生物不生长，温度过低，甚至会死亡。 处于最适生长温度时，生长速度最快，代时最短。 超过最高生

43、长温度时，微生物不生长，温度过高，甚至会死亡。,（一）微生物生长的三个温度基点,（二）微生物生长温度类型,低温型微生物（嗜冷微生物） 中温型微生物（嗜温微生物） 高温型微生物（嗜热微生物）,低温型微生物 最适生长温度在520,主要分布在地球的两极、冷泉、深海、冷冻场所及冷藏食品中。 例：假单孢菌中的某些嗜冷菌在低温下生长，常引起冷藏食品的腐败。 嗜冷微生物在低温下生长的机理，目前还不清楚，据推测有两种原因： 它们体内的酶能在低温下有效地催化，在高温下酶活丧失细胞膜中的不饱和脂肪酸含量高，低温下也能保持半流动状态，可以进行物质的传递。,中温型微生物 室温型主要为腐生或植物寄生，在植物或土壤中；

44、最适生长温度为20 40 ，大多数微生物属此类； 体温型主要为寄生，在人和动物体内。 高温型微生物 最适生长温度为50 60 ,主要分布在温泉、堆肥和土壤中。 在高温下能生长的原因：酶蛋以及核糖体有较强的抗热性核酸具有较高的热稳定性（核酸中G+C含量高（tRNA），可提供形成 氢键，增加热稳定性 ）。 细胞膜中饱和脂肪酸含量高，较高温度下能维持正常的液晶状态。,高温微生物的特点 生长速度快，合成大分子迅速，可及时修复高温对其造成的分子损伤。 耐高温菌具应用优势 在减少能源消耗、减少染菌、缩短发酵周期等方面具重要意义。,不同生理生化过程的最适温度,微生物不同生理活动要求不同温度，所以， 最适生长

45、温度 发酵速度快、积累代谢产物多。,以青霉素的生产为例：培养165小时采用分段控制温度的方法，其青霉素产量比始终在30 培养提高了14.7%。 分段控制方式：05小时，30 ；540小时，25 ；40125小时，20 ；125165小时，25 。,1、高温对微生物的影响 高温下蛋白质不可逆变性，膜受热出现小孔，破坏细胞结构（溶菌）。 微生物对热的耐受力与以下因素有关: (1)微生物种类及发育阶段 嗜热菌比其它类型的菌体抗热 有芽孢的细菌比无芽孢的菌抗热 微生物的繁殖结构比营养结构抗热性强 老龄菌比幼龄菌抗热,（三）高温与低温对微生物的影响,(2)微生物对热的耐受力还受环境条件影响 与培养基的营

46、养成分有关 培养基中蛋白质含量高时比较耐热. 与pH 有关 pH适宜时不易死亡，pH不适宜时，容易死亡. 与水分有关 含水量大时容易死亡，含水量小时不容易死亡. 与含菌量有关 含菌量高，抗热性增强，含菌量低，抗热性差。 与热处理时间有关 热处理时间长，微生物易死亡。,当环境温度低于微生物的最适生长温度时，微生物的生长繁殖停止，当微生物的原生质结构并未破坏时，不会很快造成死亡并能在较长时间内保持活力，当温度提高时，可以恢复正常的生命活动。 低温保藏菌种就是利用这个原理。一些细菌、酵母菌和霉菌的琼脂斜面菌种通常可以长时间地保藏在4的冰箱中。 当温度过低，造成微生物细胞冻结时，有的微生物会死亡，有些

47、则并不死亡。,2、低温对微生物的影响,造成死亡的原因 冻结时细胞水分变成冰晶，冰晶对细胞膜产生机械损伤，膜内物质外漏。 冻结过程造成细胞脱水 冻结速度对冰晶形成有很大影响，缓慢冻结，形成的冰晶大，对细胞损伤大；快速冻结，形成的冰晶小、分布均匀，对细胞的损伤小，因此，利用快速冻结可以对一些菌种进行冻结保藏，一般情况下在菌悬液中再加一些甘油、糖、牛奶、保护剂等可对菌种进行长期保藏。,微生物对氧的需要和耐受力在不同 的类群中变化很大，根据微生物与 氧的关系,可把它们分为几种类群: 专性好氧菌: 好氧菌 微好氧菌： 兼性厌氧菌 耐氧厌氧菌： 厌氧菌 (专性)厌氧菌：,二、氧气对微生物生长的影响,氧浓度

48、对不同微生物生长的影响,专性好氧菌（strict aerobe）,必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。,微好氧菌（microaerophilic bacteria）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能，,兼性好氧菌（facultative aerobe）,耐氧菌（aerotolerant anaerobe）,可在分

49、子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸链，依靠专性发酵获得能量。细胞内存在SOD和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。,厌氧菌（anaerobe）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表面上不能生长，只有在其深层的无氧或低氧化还原电势的环境下才能生长；生命活动所需能量通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。,严格厌氧微生物并不是被气态的氧所杀死，而是由于不能解除某些氧代谢产物的毒性而死亡。 在氧还原为水的过程中，可形成某些有毒的中

50、间产物，例如，过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（ O2 ）等。超氧阴离子为活性氧，兼有分子和离子的性质，反应力极强，极不稳定，可破坏膜和重要生物大分子，对微生物造成毒害或致死。 好氧微生物具有降解这些产物的酶，如过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶等， 而严格厌氧菌缺乏SOD，故易被生物体内极易产生的超氧阴离子自由基毒害致死。,厌氧菌的氧毒害机制 SOD学说,各类菌所含对氧解毒酶,专性好氧菌 SOD，过氧化氢酶 兼性厌氧菌 SOD， 过氧化氢酶 专性厌氧菌 二种酶均无 微好氧菌 少量SOD 耐氧菌 SOD， 过氧化物酶,H2O + 1/2 O2 2 O2 + 2H+ O2 + H2O2 2H

51、2O,O2 + e O2 ( O2 ) 超氧阴离子在细胞内可由酶促或非酶促形成。 超氧物阴离子歧化酶是在生物进化中发展出来的一种自我保护方式。 兼性厌氧菌E.coli在发生SOD缺失突变后，就会变成一种“严格厌氧菌”。,生物体中超氧阴离子的形成与去除,SOD 好氧生物 和耐氧细菌,过氧化氢酶 好氧生物,过氧化物酶 NADH2NAD 耐氧菌,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。 培养好氧微生物：需震荡或通气，保证充足的氧气。 培养专性厌氧微生物：需排除环境中的氧气，同时 在培养基中添加还原剂，降低 培养基中的氧化还原电位势。 培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。

52、,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。 改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径：如：酵母菌在pH4.5-5产乙醇，在 pH6.5以上产甘油、酸。 环境pH值还影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响营养物质吸收，或有毒物质的毒性。,三、pH值与微生物生长的相互影响,（一）环境pH值对微生物生长的影响,微生物的生长pH值范围极广，从pH8都有微生物能生长。但是绝大多数种类都生活在pH5.09.0之间。 微生物生长的pH值三基点： 各种微生物都有其生长的最低、最适和最高pH值。低于最低、或超过最高生长pH值时，微生物生长受抑制或导致死亡。 不同的微生物最适生长的pH值不同，根

53、据微生物生长的最适pH值，将微生物分为： 嗜碱微生物：硝化细菌、尿素分解菌、多数放线菌 耐碱微生物：许多链霉菌 中性微生物：绝大多数细菌，一部分真菌 嗜酸微生物：硫杆菌属 耐酸微生物：乳酸杆菌、醋酸杆菌,（二) 不同微生物对pH要求不同,一些微生物生长的pH值范围,不同微生物的生长pH值范围,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。在发酵工业中，控制pH值尤其重要。 举例：Aspergillus niger在pH22.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.56.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。 丙酮丁醇梭菌在pH5.57.0范围

54、时，以菌体生长为主，而在pH4.35.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。,生长的最适pH值与发酵的最适pH值,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境pH值要求不同。 例如：丙酮丁醇梭菌 在pH值=5.57.0时，以菌体生长为主 在pH值=4.35.3时，进行丙酮丁醇发酵 同一种微生物由于环境pH值不同，可能积累不同的代谢产物。 例如：黑曲霉 pH值=23时，产物以柠檬酸为主，只产少量草酸。 pH值在7左右时，产物以草酸为主，只产少量柠檬酸。,（三）微生物细胞内的pH值,虽然微生物生活的环境pH值范围较宽，但是其细胞内的pH值却相当稳定，一般都接近中性。 这种维持细胞内稳定中性pH值

55、的特性能够保持细胞内各种生物活性分子的结构稳定和细胞内酶所需要的最适pH值。微生物胞内酶的最适pH值一般为中性，胞外酶的最适pH值接近环境pH值。,（四）微生物的生命活动对环境pH值的影响,微生物在生长过程中也会使外界环境的pH值发生改变，原因： 由于有机物分解： 分解糖类、脂肪等，产生酸性物质，使培养液pH值下降； 分解蛋白质、尿素等，产生碱性物质，使培养液pH值上升 由于无机盐选择性吸收： 铵盐吸收（(NH4)2SO4 H2SO4）， pH 硝酸盐吸收(NaNO3 NaOH)， pH,培养过程中调节pH值的措施 过酸时：加入碱或适量氮源，提高通气量。 过碱时：加入酸或适量碳源，降低通气量。

56、,NH4+被吸收,NO3+被吸收,配制培养基时调整pH值的措施：,（五）酸碱添加剂的抑菌机理,酸类物质： 无机酸：与H+浓度成正比的高氢离子浓度，可引起菌体表面蛋白的变性和核酸的水解，并破坏酶类的活性 有机酸：与不电离的部分成正比,故有时有机酸的抑菌效果无机酸。作为食品防腐剂的有机酸如苯甲酸和水杨酸可与微生物细胞中的成分发生氧化作用，从而抑制微生物的生长。 碱类物质：强碱可引起蛋白质、核酸大分子变性、水解，以杀死或抑制微生物。食品工业中常用石灰水、NaOH、Na2CO3等作为机器、工具以及冷藏库的消毒剂。,第四节 微生物生长繁殖的控制,1、高温灭菌（消毒）法：是最常用的物理方法。高温可引起蛋白

57、质、核酸等活性大分子氧化或变性失活而导致微生物死亡。,一、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法,（一）温度,干热灭菌法（dry heat sterilization） 焚烧法（incineration）：是将被灭菌物品在火焰中燃烧，使所有的生物质碳化。简单、彻底，但对被灭菌物品的破坏极大。适用于无经济价值的物品灭菌，及不怕烧的实验器具，如接种环、镊子、试管或三角瓶口的灭菌等。 干燥热空气灭菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至150170 ，维持12小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，不适合液体样品，及棉花、纸张、纤维和橡胶类物质的灭菌。 特点：由于空气传热穿透力

58、差，菌体在脱水状态下不易杀死，所以温度高、时间长。,湿热法(moist heat sterilization) ： 特点：温度低、时间短、灭菌效果高 原因： 1) 菌体内含水量越高，则凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力强； 4) 湿热易破坏细胞内蛋白质大分子的稳定 性，主要破坏氢键结构。,高压蒸汽灭菌法 利用水的沸点随水蒸气压力的增加而上升，以达到100 以上高温灭菌的方法。 方法： 121（1kg/cm2或15磅/英寸2）维持15-20min。 112（0.5kg/cm2或8磅/英寸2）20-30min。 115（0.75kg/cm2或11磅/英寸2）20-3

59、0min。 应根据灭菌物品的性质或成分选择灭菌温度 例如： 生理盐水、营养琼脂等培养基用121 。 葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用112 。 适用： 耐高温物品，玻璃仪器、含水或不含水的物品。,注意事项： 排净冷空气； 灭菌终了，缓慢降压； 灭菌结束，趁热取出物品。,高压蒸汽灭菌锅,高温对培养基的影响及其防止措施,高温对培养基的不利影响： 会产生混浊或形成不溶性沉淀 营养成分被破坏（ PO4-3存在，葡萄糖生成酮糖，菌不利用）； 色泽加深（褐变如产生氨基糖等）； 改变培养基的pH值（通常下降0.2） ； 形成有害物质，抑制微生物生长； 消除有害影响的措施 采用特殊的加热灭菌法 过滤除菌法 加入螯合剂,煮沸消毒法 将水加热至100，煮沸15min30min，可杀死所有营养细胞和部分芽孢，达到消毒物的目的。 巴斯德消毒法（Pasteurization）： 用较低的温度来杀死