细胞工程1植物细胞

1、第三章 细胞工程-植物细胞工程,College of Chemical Engineering, GuiZhou University,Outline,1 概述 2 植物细胞工程 一、植物组织培养,二、植物细胞培养 三、人工种子 四、植物细胞融合,1972年卡尔森等通过两个烟草品种之间原生质体的融合，获得了第一个体细胞杂种。,1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种“Potamato”。,目前，已得到栽培烟草与野生烟草、栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种及其后代，获得了有价值的新品系或育种上有用的新材料。,白菜,甘蓝,白菜

2、甘蓝,1 概述 一、细胞工程的概念,是指在细胞水平上，以细胞生物学理论和技术为基础，结合现代工程技术手段以及其他学科的科学原理和技术，研究、开发和利用细胞的现代生物技术。,细胞工程,植物组织和细胞培养技术,干细胞技术,动物组织和细胞培养技术,细胞融合技术,细胞核移植技术,胚胎移植技术,细胞工程:P54,微生物细胞工程、 植物细胞工程和 动物细胞工程,根据研究对象不同， 可将细胞工程分为,（一）基本概念及研究进展 1.定义 植物组织培养： 是指将植物机体的某一部分(包括器官、组织等)取出，使其在无菌和人为控制外因（养分、光照、温度、湿度等）条件下进行培养，从而使其分化、发育出整体植株的技术。,2

3、 植物细胞工程,一、植物组织培养,2.研究进展,植物组织培养的理论依据主要有两点： 19世纪30年代施莱登和施旺提出的细胞学说，即细胞是生物有机体的基本结构单位这一理论，使人们想到并试图应用无菌培养方法来培养植物的离体部分,在人工控制条件下来研究其生长、发育和分化的规律。,1902年，德国植物学家Haberlandt提出了植物细胞全能性学说。植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞而不影响细胞增殖的观点。并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力。,1934年美国的White，利用番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，发现B族维生素对培养的离体根生长具有重要作用。 创立了White培养基。,

4、1943年White发表了植物组织培养手册的专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科。,1939年，Gautheret连续培养胡萝卜根形 成层首次成功,1948 年，Skoog和崔徵通过对烟草茎切段和髓培养组织的研究，确定了腺嘌呤生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。,F.Skoog,1956年Miller等发现了激动素。控制器官分化的激素模式变为激动素生长素的比例关系。指出其能有力诱导愈伤组织分化,促进组培发展。,1958年，英国科学家Steward 等用进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，首次获得植株再生成功。使细胞全能性理论得到证实，这是植物组培的第一次突破。,细

5、胞全能性,已经分化的体细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能，细胞的这种特性叫做细胞的全能性。,生物体的每一个体细胞都包含有该物种所特有的全套遗传信息，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。受精卵的全能性最强。其次是生殖细胞，再次是体细胞,在离体时，在一定的营养物质、激素、其他外界条件下，可能表现出全能性，发育成完整的植株。,植物组织培养的一般程序：,脱分化,再分化,诱导根、芽顶端分生组织,通过悬浮液培养分散成单细胞,离体的植物器官、组织或细胞,愈伤组织,根、芽,小植株,脱分化,再分化,植物组织培养,胚状体,小植株,再分化,单细胞,通过悬浮培养分散成,包以人工种皮，形成人工种子,1.预备阶段,2

6、.诱导去分化阶段,3.继代增殖阶段,4.生根成芽阶段,5.移栽成活阶段,（二）植物组织培养的操作技术 P56,切取 形成层,无菌接种,诱导愈伤组织 的形成,试管苗的形成,培养室,移栽,诱导去分化阶段,再分化,预备阶段,继代增殖阶段,生根成芽阶段,移栽成活阶段,A Microspores isolated from banana anthers. Bar 14 m. B Development of callus from anthers after 5 months on induction medium. Bar 2 mm. C Androgenic embryos formed on ca

7、lli. Bar 4 mm. D Haploid plantlets regenerated from anthers. Bar 3 cm,Assani et al. Plant Cell Rep 2003, 21, 511516,1.预备阶段,（1）选择合适的外植体。选择时应考虑的因素：,外植体的选择一般以幼嫩的组织或器官为宜。,（2）除去病原菌和杂菌。,外植体表面消毒、培养基灭菌-在超净台上接种 、灼烧接种工具、在火焰附近操作等,外植体,自来水多次漂洗,消毒剂处理,无菌水反复冲洗,无菌滤纸吸干,由于物种的不同、外植体的差异，组织培养的培养基也是多种多样，但它们通常都包括以下三大类组成成分：

8、 含量丰富的基本成分，如蔗糖或葡萄糖高达每升30g，以及氮、磷、钾、镁等。 微量无机物，如铁、锰、 硼酸等。 微量有机物，如激动素、吲哚乙酸、肌醇等。,（3）配制适宜的培养基。,分裂素,生长素,问：培养基的成分？ 碳源,氮源 , 无机盐,生长因子,水, 除此，培养基中还需加入植物激素或其类似物,培养基,MS培养基:其特点是无机盐和离子浓度较高； B5培养基:其特点是含有较低的铵； White培养基:其特点是无机盐低，适于生根； N6培养基:其特点是KNO3和（NH4）2SO4含量较高,适于花药培养； KM8P培养基:其特点是有机成分较多，适于 原生质体培养。,培养基多以命名人的名字命名。,目前

9、，比较流行的培养基有：,生长素 吲哚乙酸(IAA)，2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)，奈乙 酸(NAA)，吲哚丁酸(IBA)。,生长素的生理作用,（1）既能促进生长，也能抑制生长； （2）既能促进发芽，也能抑制发芽； （3）既能防止落花落果，也能疏花疏果。,浓度较低,促进生长;浓度过高,抑制生长甚至杀死植物。,生长素的生理效应： 使胞壁酸化，增加可塑性，导致细胞伸长变； 促进RNA和蛋白质的合成，保证可持续生长。,植 物 激 素,植物对生长素的敏感程度如何呢?,（1）营养器官生殖器官 （2）根芽茎 （3）幼嫩细胞衰老细胞 （4）双子叶植物单子叶植物,植物生长素错当农药 晚稻疯长比人高,当培养基

10、中CTK/IAA的比值高时， 愈伤组织形成芽； 当CTK/IAA的比值低时， 愈伤组织形成根； 如二者的浓度相等， 则愈伤组织保持生长而不分化； 所以，通过调整二者比值可诱导愈伤组织形成完整的植株。,2. 分裂素 6-苄基嘌呤(6-BA)，激动素(kinetin, KT)，玉米素，嘌呤衍生物, 6-呋喃氨基嘌呤，K N 。,1957年斯库格和米勒在进行烟草的组织培养时发现：,细胞分裂素（CTK）,吲哚乙酸(IAA)，,将拟南芥组织置于含生长素IBA和细胞分裂素的环境中诱导愈伤组织的产生,生长素只促进核的分裂(因促进了DNA的合成)，而与细胞质的分裂无关。 而细胞分裂素主要是对细胞质的分裂起作用

11、， 所以，细胞分裂素促进 细胞分裂的效应只有 在生长素存在的前提 下才能表现出来。,在超净工作台接种,外植体是植物组织培养中用来进行离体无菌培养的离体材料，可以是器官、组织、细胞和原生质体等。组织培养的第一步就是让这些器官或组织切断去分化. 所谓去分化（也叫脱分化）是指离体的植物组织器官或细胞，在外源的生长素类物质的诱导下重新处于旺盛有丝分裂的分生状态，形成一团结构疏松、颜色浅而透明的、高度液泡化的、呈无定形状态的薄壁细胞群的愈伤组织的过程。,2.诱导去分化阶段,愈伤组织细胞的状态,是指在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，它具有再分化成为完整植物体的潜能，一般在外植体的切面处产

12、生。,愈伤组织： 在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞（细胞排列疏松、无规则）。,分化程度低，属 于胚胎干细胞。,分化程度高，属 于组织干细胞。,Arabidopsis Tobacco 3.0 mg/L 2,4-D,Genotypic Effects on Callus Morphology,拟南芥,2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D),Medium Effects on Tobacco Callus Morphology,0.1 mg/L kinetin 3.0 mg/L 2,4-D,3.0 mg/L 2-iP 2.0 mg/L IAA,friable callus,compac

13、t callus,异戊烯基腺嘌 呤，属于细胞 分裂素,愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式和胚状体方式两种。,不定芽方式是在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。 胚状体方式是由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过有性生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体。,不定芽方式和胚状体方式是植物组织培养中最常见和最重要的两种方式。胚状体方式比不定芽方式有更多的优点，如胚状体产生的数量比不定芽多，胚状体可以制成人工种子，等等。,继代培养是愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失

14、，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养。,3.继代增殖阶段,愈伤组织只有经过重新分化才能形成胚状体，继而长成小植株。再分化是指愈伤组织继续培养，又可以重新分化成根或芽等器官的过程。,4.生根成芽阶段,再分化阶段 （形芽和根）,5.移栽成活阶段,生长于人工照明玻璃瓶 中的小苗，要适时移栽 室外以利生长。,去分化,再分化,形成植株,愈伤组织,愈伤组织 分化出芽,形成试管苗,实例：非洲紫罗兰的组织培养,决定植物细胞脱分化、再分化的关键因素是什么?,影响脱分化的一个重要因素是植物激素。当细胞分裂素与生长素共同使用时，能强烈促进愈伤组织的形成，而两者不同的

15、浓度配比在再分化过程中，分别对诱导 根或芽的产生起关键作用。当细胞分裂素与生长素浓度比高时，有利于芽的发生；浓度比低时，有利于根的发生。,胚状体是怎样形成的？培养胚状体有何意义？,愈伤组织的形态发生主要有不定芽方式和胚状体方式两种。而后者需要在愈伤组织形成后，对其进行处理，形成分散的单个细胞，再诱导其分化出具有胚芽、胚轴、胚根的胚状体，进而发育成完整植株。诱导离体的植物组织形成具有生根发芽能力的胚状结构，包裹上人造种皮制成人工种子可以解 决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题。,植物细胞(组织)培养,植物组织培养与有性生殖相比，有什么优势：, 繁殖速度快； 保持亲本的优良性状（因为

16、是无性生殖）； 培育无病毒的植株 不受自然生长季节的限制（因为在具有一定人工设施的室内生产）。,二、植物细胞培养,是指在离体条件下，将愈伤组织或其他容易分散的组织置于液体培养基中，进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体及相关产物的一种技术。,植物细胞培养,p58,植物细胞（组织）培养流程,悬浮细胞培养,提取纯化 产物,收集细胞,通过植物组织培养的药物：奎宁、长春碱、洋地黄、紫草素、人参皂甙等,药物制剂,植物细胞培养的方法,植物细胞培养的方法，根据培养对象，植物细胞培养主要有悬浮细胞培养（单细胞培养）、单倍体培养、原生质体培养等。按照培养系统可分为

17、悬浮培养系统、固定化培养系统等。 单倍体培养： 主要是指花药培养，即将花药在人工培养基上进行培养，从小孢子（雄性生殖细胞）直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株；或通过组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。单倍体植株经人为加倍后可得到完全纯合的个体。 原生质体培养：是将植物的体细胞经过纤维素酶等处理后去掉细胞壁，获得的原生质体在无菌培养基上上长、分裂，最终长成植株。 悬浮细胞培养：在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。,一、悬浮培养系统（cell suspension culture） 悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细

18、胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。,适于悬浮培养,适于再生植株,适于悬浮培养,细胞悬浮系的建立,二、 单细胞培养,1、平板培养 2、看护培养 3、微室培养 4、双层滤纸培养,悬浮培养不能对某一细胞进行定点观察和分析，也就不能进行定点选择。因此，在进行细胞株（种子细胞）选择和需要对细胞活动跟踪观察的情况下，必须进行真正意义上的单细胞培养。由于植物细胞的团聚性，单细胞培养还比较困难。,平板培养(plate culture)：将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。 单细胞的分离：用于平板培养的小细胞团不能超过6个细胞，所以过滤时筛网的网孔大小要合适。 单细胞悬浮液的制备：分离

19、的单细胞经低速离心，培养液洗涤2次后，调整密度为5105ml。 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，厚度约12mm。 封口：用石蜡膜封培养皿。,1、细胞平板培养,看护培养（nurse culture）： 是由Muir1954年设计的。 操作方法： 在固体培养基上置入一块 活跃生长的愈组织，再在愈 伤组织上放一小片滤纸，待 滤纸湿润后将细胞接种于滤 纸上。当培养细胞长出微小 细胞团以后，将其直接转至 琼脂培养基上让其迅速生长,2、看护培养,它可对单细胞进行活体连续观察。 这一方法也可用于原生质体培养观察细胞壁的再生和细胞分裂过程。,

20、3、微室培养,Horsch等（1980）将平板培养与饲养层培养技术相结合，建立了双层滤纸植板培养方法。,4、双层滤纸培养,初生代谢产物 次生代谢产物 生物大分子,三、植物细胞规模化培养体系的建立,(1）准确选择能产生目的化合物的植物种类； (2）尽量选择自然状态下产生天然产物的组织器官 为外植体； (3)高产种子细胞克隆的方法：单细胞培养后，将单细胞扩增形成的愈伤组织分2份，1份成分含量分析，另1份保留培养。,1、种子细胞的选择,2、种子细胞系的增殖与放大培养,种子细胞增殖初期一般采用摇瓶培养，摇瓶体积从几百毫升到几升逐级放大。当细胞数量增加到一定值后，应转移至体积较小的生物反应器培养。,（1

21、）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。 （2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。 (3)半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。,3、大规模培养体系的建立,4生物反应器类型及特点,机械搅拌式培养系统,Stirred Tank Bioreactors,An external motor is used to agitate the growth medium with im

22、pellers. Sterile air or combinations of gases can be introduced (sparkling),植物细胞培养罐及模式图,增加溶氧量,使细胞与氧气、营养物质充分接触,提取、纯化有效物质,适宜的酸碱度,气压搅拌式培养系统,Bubble Column Bioreactor (Airlift Reactor),Introduction of sterile air or pure gases is used both for agitation and oxygenation,Internal Loop Airlift Bioreactor,Tu

23、be placed inside the reactor creates internal circulation loop,External Loop Airlift Bioreactor,Circulation through an external loop,固定化细胞反应器培养,人工种子,体细胞胚胚 状 体,人工胚乳是包埋体细胞胚的胶状介质,人工种皮是包在人工种子最外层的胶质薄膜。,体细胞胚是制作人工种子的起始材料。它既可由外植体的表皮细胞直接产生，也可由愈伤组织的表层细胞产生。,P66,三、人工种子,任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。,人

24、工种子的种类 根据包被的程度可将人工种子分为三大类：,裸露的或休眠的繁殖体,人工种皮包被的繁殖体,水凝胶包被的繁殖体,人工种子研制的意义,人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种，易于机械化操作； 不受季节限制，不受环境制约，胚状体数量多，繁殖快、有利于工厂化生产； 有利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有的一些植物，也可大量繁殖无病毒材料; 可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力； 体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以固定杂种优势。,在实际应用中主要有三大难题有待克服： 1）许多重要植物还不能培养出大量的高质量的体细胞胚。 2）现有的人工胚乳和种皮还不够理想，不能

25、有效地防止微生物的腐蚀。 3）人工种子的贮藏有待进一步完善。,1.培养条件可以人为控制，免遭大自然灾害性气候的不利因素，且具有省地省工可直接在田间播种等优点。 2.在人工种子制作中，可加入营养物质、植物生长调节剂、固氮菌、杀虫剂等，有利于幼苗茁壮成长，提高作物产量。 3.人工种子可以工业化生产，提高农业的自动化程度。 4.用人工种子播种可以节约粮食。 例如，一个12 L的发酵罐在20d内生产的胡萝卜胚状体，可以制成1000万粒人工种子，满足几千公顷农田的种植需要，与天然种子相比，大大节约了粮食。 5.一些难以得到天然种子的珍稀植物或脱毒苗、基因工程植株，均可利用人工种子技术加速用于生产。,人工

26、种子技术确实有着诱人的前景：,用人工种皮包被体细胞胚，可以制造人工种子 人工种皮： 海藻酸钠 解决有些植物结子困难、发芽率低、繁殖困难等问题,制作过程,体细胞胚与藻酸钠混合后，滴入到硝酸钙或CaCl2中， CaCl2浓度：2.0%-2.5% 时间：20min-30min 无菌水漂洗20min，形成人工种子,细胞融合也称体细胞杂交，又叫无性杂交，是指利用现代科学技术，分别取出两种生物的单个细胞，然后使这两种不同的生物细胞在同一培养器中，用无性的人工方法促使两者互相凝集并发生细胞之间的融合，进而导致基因重组，产生能同时表达两个亲本细胞有益性状的细胞杂交技术。,四、植物细胞融合,植物体细胞杂交过程示

27、意图,杂种植株,融合的原生质体AB,再生出细胞壁,脱分化,愈伤组织,再分化,1、过程,植物细胞的融合,植物组织培养,植物细胞A,原生质体B,原生质体A,杂种细胞AB,去 壁,去 壁,人 工 诱 导,方法？,促进融合的方法？,融合完成的 标志,植物细胞B,去壁,去壁,纤维素酶果胶酶,原生质体,植物细胞,原生质体融合,离心、振动、电刺激、 聚乙二醇,再生细胞壁,杂种细胞,去分化,愈伤组织,杂种植株,激素,筛选,等量,激素,再分化,植物体细胞杂交过程示意图,(一) 原生质体的制备,方法：,取材与除菌,酶解,分离,洗涤,P61,鉴定,植物细胞壁的主要成分是纤维素，还有少量的半纤维素、果胶、蛋白质等，细胞壁的去除方法主要有机械法和酶消化法两种方法。 机械法 首先将外植体（或愈伤组织）进行高渗溶液(可用盐或糖溶液)处理,结果会导致细胞脱水、质壁分离。之后再以组织捣碎机等高速机械切割细胞，从而获得脱壁细胞。该法虽然简单易行，但原生质体损伤严重、数量少。,酶法 利用消化细胞壁的酶，破坏植物细胞壁，从而释放出植物原生质体，这是目前应用的