酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP-MMP-9的活性

1、蛋白质高度结构的预测酶催化剂光谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性食道癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性变化及其临床意义，综合修订实验-2，该实验共包括以下三个部分的第一部分，蛋白质高度结构的预测第二部分。 酶催化剂光谱法被称为血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性的第三部分，食道癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性变化及其临床意义，第一部分，蛋白质的高度结构预测，蛋白质的三次元结构，空间结构或高度结构，是指蛋白质分子中原子和化学基在三度空间上的序列的高度结构，蛋白质表达其生物功能和活性x线结晶学方法是迄今研究蛋白质结构的最有效方法，其可达到的精度与其他方法

2、无法比拟，但其缺点是蛋白质晶体难以培养，晶体结构测定周期长。 近年来发展起来的多维核磁共振法可以直接测定蛋白质在溶液中的构象，但由于对样品的需求量大、纯度要求高，所测定的蛋白质分子量一般不超过20000 Da等原因，受到很大限制。 截至2008年6月，与迅速增长的庞大的染色体组核酸数据相反，已知三级结构的蛋白质数还不到6万个。 (来自蛋白质结构数据PDB的聚合)利用从蛋白质初生结构中提供的氨基酸排列顺序信息进行高级结构预测的方法已针对这种需要而发展。 蛋白质的初生结构决定高级结构的论点还是进行蛋白质三级结构预测的理论基础。 目前，蛋白质三级结构预测方法包括： (1)基于已知结构(如晶体结构)利

3、用分子动力学方法研究蛋白质分子、核酸分子或复合物的动态性质。 (2)使用能量最优化或分子动力学方法，使结构模型最优化或整体结构已知时，制作点突然地变异体的结构。 (3)由相似物的结构残奥仪构建未知蛋白质的结构。 (结合2D-NMR数据、X-RAY粗结构数据和其他实验数据，建构蛋白质的整体模型结构模型。 (5)在上述条件均不满足的情况下，从初生结构进行二级结构预测，精确度65。 (6)根据已知的二级结构进行碎片堆积，根据从已知构造得到的几个规则进行化学基筛选，筛选出可能的构造，通常可以得到很多可能性，不能得到唯一正确的堆积方式。 (7)单体结构已知时，制备复合体或多聚体结构，参考复合体或聚合物本

4、身的性质，利用几何匹配和最大接触面积规律进行。 从被测定蛋白质序列检索蛋白质结构数据库(例如，PDB、SWISS-PROT等)，得到许多类似序列(同源序列)，将其中一个(或几个)选定为被测定蛋白质序列的数字大板块的测定蛋白质序列是所选择的数字大板块插入各种可能空穴以使两者的保守位置尽可能对齐的建模：调整被测蛋白质序列中主链的各原子的位置，利用生成与数字大板块相同或类似的空间结构、被测蛋白质的空间结构模型的能量最小化原理，使被测蛋白质侧链化学基成为能量最小的位置。 同源建模方法的蛋白质三级结构预测一般分四个阶段完成：SWISS-MODEL蛋白质结构预测，SWISS-MODEL实现同源建模方法的未

5、知序列三级结构预测。 这项服务成立于1993年，开创了自动建模的先河，是迄今为止应用最广泛的免费服务之一。 http:/Swiss /Swiss-model.html、First Approach mode (简单模式)模式是一种提供简单用户界面的数字大板块和常见蛋白质三级结构的软件，RasMol，WPDB，Cn3D，第二部分，酶催化剂光谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性，根据常见的阳离子电泳技术支持介质，进行纸阳离子电泳(Paper electrophorisis ) 冰乙酸纤维膜阳离子电泳琼脂糖凝胶电泳多亚克力酰胺中的hores is

6、-聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳SDS-PAGE，也称SDS-PAGE。 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)根据支撑介质的形状而不同，薄层阳离子电泳板阳离子电泳柱阳离子电泳、阳离子电泳装置、垂直阳离子电泳系统、水平电泳系统、聚丙烯酰胺凝胶电泳原理、聚丙烯酰胺凝胶为N-甲基双丙烯酰胺(n， N -methylene-Bisacylamide，简称bis )是在加速剂n，n，n，N-四甲基乙亚胺(n，n，n，N-简称AP )的作用下使交联为三次元网状结构的凝胶聚合，以该凝胶为支撑体的阳离子电泳为聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳(polyacrylamide ) n，n， N-亚甲基(亚甲基)双亚克力酰胺、亚

7、克力酰胺、聚亚克力酰胺、聚丙烯酰胺凝胶具有以下特性，化学性能稳定，不与被分离物发生化学反应，对不溶于许多溶剂的pH和温度变化几乎没有稳定的吸附和电渗析作用，Acr纯度高， 如果操作条件一致，则样品分离反复性好，样品难以扩散，使用量少，灵敏度达到10-6g的凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择适当的浓度，通过改变单体和交联剂的浓度来调节凝胶孔径的极限分辨率高，特别是不连续因此，具有比醋酯纤维薄膜阳离子电泳、琼脂糖凝胶电泳等高的极限分辨率。SDSPAGE原理、聚丙烯酰胺凝胶阳离子电泳为网状结构，有分子筛效应，蛋白质在阳离子电泳中保持完整状态，蛋白质可分为其中三个要素：蛋白质大小、形状和电荷。

8、SDS-PAGE仅通过蛋白分子量亚单位分离蛋白。 该技术首先于1967年由shapiro创立，他们在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入络离子污染清除剂和强还原剂之后发现，蛋白质亚单位的电泳淌度主要取决于亚单位分子量的大小，电荷因素可忽略不计。 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate )是一种阴络离子清除剂，作为改性剂和溶解助剂，它破坏分子内和分子间的氢键，折叠分子，破坏蛋白分子二、三级结构。 另一方面，巯基乙醇等强还原剂，二硫苏糖醇可切断胱氨酸残馀化学基之间的二硫键。 在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白SDS胶束，带有的负电荷大大

9、超过蛋白本来的蛋白量，由此消除了不同分子间的电荷差和结构差。 因此，在阳离子电泳时，蛋白质分子的移动速度主要取决于蛋白质分子的大小。不同分子量蛋白质在凝胶中的运动模式图、不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量蛋白质混合物分离能力的关系、肿瘤细胞球的侵袭转移、肿瘤细胞球的侵袭是肿瘤细胞球粘结和横穿细胞球外基质，包括3个重要步骤：粘结基底膜，切断基底膜蛋白形成切口，细胞球切割肿瘤细胞球对周围组织和血管的侵袭是肿瘤细胞球转移的重要步骤。 转移的肿瘤细胞球在原巢外生存和增殖，这是癌症对人类生命的最大威胁。 细胞球间基质结构图，细胞球外基质(extracellular matrix，ECM )的主要成分由胶

10、原蛋白、糖蛋白、蛋白粗多糖和氨基葡萄糖组成。 ECM以上皮或内皮细胞球的化学基底部即基底膜(BM )的形式存在，而细胞球间结构以间质结缔组织(interstitial connective tissue )的形式存在。胶原是ECM的主要成分，目前至少有12种不同的胶原类型，其中、型胶原是间质结缔组织中的主要成分。 模糊的原则主要存在于基底膜内。 肿瘤细胞球侵袭是细胞球增殖、分化、转移相关基因及其表达调控模式的变化和促进细胞球转移的外在因素两方面的共同作用。 肿瘤细胞球侵袭的分子反应历程一盏茶尚不清楚，但是发现了许多控制细胞球侵袭转移的重要分子及其信号通路。 肿瘤细胞球在其表面接纳体与ECM中的

11、各种成分附着后，通过激活或分泌细胞蛋白分解酶催化剂类来分解基质，从而形成局部溶解区，构成肿瘤细胞球转移的运行途径。 一般恶性肿瘤细胞球具有较强的蛋白水解作用作用，侵蚀破坏包膜，促进转移。 目前关注的酶催化剂主要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(PA )和金属蛋白酶(MMP )类，如胶原酶、底物分解酶催化剂、玻璃酸酶催化剂。 MMPs家族的成员在细胞球中根据表达部位分为细胞质型和膜型两种。 前者分布在细胞质中，后者在膜中表达。 细胞质型MMPs根据其作用基质的专一性、易感性和氨基酸排列顺序的同源性，可含有(1)间质胶原酶、MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用基质主要含有间质

12、胶原、和(2)明胶酶、MMP-2和MMP-9， 其作用基质主要为型胶原和动物胶，型胶原也能分解，而间质胶原是不可分解(含有MMP-3、MMP-7、MMP-10及MMP-11的间质溶解素，其作用基质主要是基质中的蛋白质粗多糖和糖蛋白，例如纤维蛋白原(FN )、拉米尼由于影响细胞球外基质，基质金属蛋白酶家族参与胚胎发育、形态发生、组织重建等过程，参与炎症、肿瘤、心血管、神经等多种疾病过程。 基质金属蛋白酶蛋白家族，MMP-2又称明胶酶a，其蛋白主要由纤维结缔组织细胞球和肿瘤细胞球产生，分子量为72kDa。 MMP-9又称明胶酶b，主要由单核细胞、宏命令噬菌体多形核白细胞和肿瘤细胞球产生。 分子量为

13、92kDa，是MMPs中分子量最大的酶催化剂。 中性白血球明胶酶相关脂蛋白(neutrophilgelatinaseassociatedlipocalin，NGAL )是1993年Kjeldsen等人在研究细胞球内存在MMP-9的形式时发现的，可与MMP-9聚合形成异源二聚体检测MMP-9和MMP-2的活性，有助于肿瘤细胞球的恶性程度和预后分析。 由n端的310螺旋、c端的螺旋和中间的8段和反平行的折叠日式榻榻米构成，这些个8段的反平行式折叠日式榻榻米构成了一个折叠日式榻榻米桶构造。 该折叠桶结构的一端是开放的，提供与配件结合的进口的另一端是用短的n端310螺旋封闭的。 在折叠罐底部的内侧排列

14、有疏水性芳香族和脂肪族氨基酸残化学基，形成疏水性核或疏水性内部，提供了用于结合亲油性配体的部位。具有NGAL的三级结构、MMP-2的结构、Pre:信号肽序列Pro:巯基化学基的前肽Zn: Zn络离子结合部分II:可以结合胶原的II型纤维蛋白原结构域H:铰链区Hemopexin :血红素蛋白结构， MMP-9的四段重复序列结构由三个螺旋和五个折叠日式榻榻米组成，包含两个亚金属铅络离子和五个钙元素络离子的右图中，一个小分子化合物位于酶活力中心，与一个亚金属铅络离子结合，NGAL与MMP-9以二硫化物方式结合，保护MMP-9的功能汕头大学医学院生物化学与分子生物学教室李恩民教授课题组以转染pcDNA

15、3空白质粒载体的SHEEC细胞球为对照，酶催化剂光谱法测定结果表明，从转染pcDNA-NGAL (-)的SHEEC细胞球分泌细胞的MMP-9和MMP-2的活性而且从转染pcDNA-NGAL ()的SHEEC细胞球分泌细胞的MMP-9和MMP-2的活性也明显提高。 有意义反义技术使NGAL基因的表达变化，表明对SHEEC细胞球分泌细胞的MMP-9和MMP-2的活性有显着影响。 m :蛋白标记； 1 .细胞球培养化学基2. pcDNA3 3. pcDNA-NGAL ()； 4. pcDNA-NGAL (-)、MMP-2和MMP-9的活性强弱与肿瘤浸润和转移能力密切相关。 动物胶是这两种酶催化剂的基

16、质。 因此，体外用酶催化剂光谱法(Zymography )测定样品(组织、细胞球培养液、血清、血浆、尿)中MMP-2和MMP-9的活性，了解肿瘤细胞球的恶性程度，监测疗效，对做评估预后有重要的指导意义。 酶催化剂光谱法的基本过程是对样品进行SDS聚酰胺(包括SDS-PAGE、0.1动物胶)电泳分离后，在存在二价金属络离子的缓冲系统下激活样品中的MMP2和MMP9，在各自的移动位置水解作用凝胶中的动物胶， 最后用熊胆碱胶凝作用，取实验原理、实验操作、样品制备：血清、血浆和尿液样品适量，直接与2SDS样品缓冲液等体积混合进行以下实验。 例如，酶活力太高，显带不好，可以适当稀释的凝胶调制：玻璃板合起

17、来放入回形针中垂直卡止。 按照表10配合分离橡胶，加入TEMED后，立即锁住，注入凝胶时，用5ml的样品枪沿玻璃板注入，然后加入异丙醇，隔离空气中的氧，促进凝胶聚合。 在操作时，请务必沿着玻璃板流下，确保玻璃板上没有气泡。 约数分钟后，如果异丙醇和糨糊之间有折射线，说明糨糊凝固了，3min时糨糊凝固了，可以注入糨糊上层的水，用吸水纸吸水。 如上表所示，配合4的浓缩橡胶，放入TEMED即可挥发。 将剩馀的佗空间充满浓缩橡胶，将梳子插入浓缩橡胶。 沿着玻璃板流下，以免玻璃中产生气泡。 插梳子时，请确保梳子是水平的。 等到浓缩橡胶凝固后，用双手分别捏住梳子的两侧上下轻轻挖墙脚。在各样品孔中装入10 l样品，阳离子电泳：4 100V，约2h；