分析化学中分第六章联用技术.ppt

1、第六章,联用技术 (Hyphenated Techniques),6.1导言 6.2新质谱法 6.3色谱质谱联用 6.4电化学光谱联用 6.5毛细管电泳光谱联用,参考书：生物质谱技术与方法，杨芃原，钱小红， 盛龙生 编著，科学出版社，2003 生命分析化学，汪尔康，陈义，科学出版社，2006,6.1导言,随着生命科学、材料科学和环境科学等的发展和需求，复杂样 品体系的分离、分析已成为分析化学的重要研究方向和研究热 点之一。 所谓复杂样品体系，不仅仅是指样品中的组分多样性，而且还包 含完全不同体系的物质共存于一个样品中。例如：无机与有机化 合物共存一体，高分子、大分子与小分子化合物共存一体，生命

2、 与非生命物质共存一体等。如果要对复杂样品体系提供全面、准 确的结构与成分表征信息，那么其分析过程可能包括从常量到微 量、痕量分析，从成分到结构、形态分析，从总体到微区、表面、 空间分布分析，从宏观形貌到微观结构分析，从静态到动态、时 间分辨分析，从破坏到非破坏分析等等。因此，为了圆满完成复 杂样品体系的全分析，需要综合利用包括色谱法和质谱法在内的 多种现代分离、分析方法。 联用技术的重要性和必要性！,本章在简介新质谱方法的同时，也将介绍色 谱-质谱联用技术及接口技术的发展，还将介 绍各种不同模式和类型的色谱-质谱联用技术 的实现、研究进展及其在生命科学研究领域 中的应用，以及其它联用技术，如

3、电化学 光谱，毛细管电泳光谱联用等。,6.2 新质谱法,6.2.1 质谱学简介及其特点 1906年J.J.Thomson发明了质谱仪(Mass spectroscopy, MS)， 但直至1920s左右质谱法才逐渐成为一种分析手段，被化学 家采用。从1940s以后MS广泛地应用于有机物质分析。 1980s末期新软电离技术的发明，能够用于分析高极性、难 挥发和热不稳定样品之后，生物质谱才发展起来。 常规质谱分析仪的质量范围是几十到2000 da。 生物质谱(新质谱法)是现代分析化学及相关生化研究的热点 之一和蛋白质组学的主要手段。,质谱法的特点： 高灵敏度，可测10-8mol以下物质的量； 快速

4、，数分钟内即可完成测试； 能同时提供样品的精确分子质量和结构信息； 既可用于定性分析，也可用于定量分析； 能有效地与各种色谱技术联用，如GC/MS， HPLC/MS，TLC/MS及CZE/MS等，用于复杂 体系分析。 MS的特点可概括为4个S: 灵敏(sensitivity)、快速 (speed)、专一(specificity)、化学计量(stoichiometry)。,在过去的几十年中，生物质谱的主要进展在于解决如 何测定大质量分子质荷比m/z及其相关的问题，主要的 研究领域包括： 如何扩大质谱仪器的质量范围？ 如何使生物大分子电离和使其带多电荷(即降低m/z)？ 如何解释大质量分子质谱？

5、如何发展生物大分子质谱测定方法？ Fred M. McLafferty et al, Science, 2006, 314, 109-112 报道了采用MS可研究质量大于200 Kda的蛋白质！,与质谱相关而获得诺贝尔奖的有： J.J.Thomson(物理1906，发明质谱技术并用于研究 气体的电导)； F.W.Aston(化学1922，用质谱仪发现了非放射性元 素的同位素)； W.Paul(物理1980，发明离子阱质谱原理与技术)； R.F.Curl、R.E.Smalley和H.W.Kroto(化学1996，用 质谱仪观察到激光轰击下产生的C60)； K.Tanaka(田中耕一)和J.B.F

6、enn(化学2002，发明 MALDI-MS和ESI-MS技术)。,生物质谱的最基本用途是能够测量多肽/蛋白质/核酸等生物大分 子的分子质量，并间接推测它的结构及相互作用。 1994年蛋白质组学第一次被提出(Marc Wilkins)，随后生物质谱 被确认为蛋白质组学技术平台的重要组成部分，认识到生物质谱 另一吸引人之处是可以取代Edman降解测序方法，了解蛋白生成 的早期结构域，以及可以鉴定翻译后修饰的能力。另外，生物质 谱还可以用来测定非共价键作用如抗体-抗原结合作用。 2001以后，随着基因组测序计划的完成，蛋白质组学的规模化 已成定局，生物质谱正在发挥着不可取代的中坚作用。 蛋白质组学

7、的研究之所以能够蓬勃发展，主要依赖于高通量分离 和分析技术的突破性进展。首先是质谱技术，尤其是软电离技术 的发展和双向(二维)凝胶电泳技术的完善，使得蛋白质的大范围 高通量分析成为可能。,蛋白质组学(Proteomics)生物质谱！,Proteomics is the study of the proteome, the protein complement of the genome. The terms ”proteomics” and “proteome” were coined by Marc Wilkins and colleagues in the early 1990s and

8、mirror the terms “genomics” and “genome”, which describe the entire collection of genes in an organism. Introduction to Proteomics, Daniel Liebler. 2002, Humana Press 蛋白质组学目前面临的最大挑战是什么？,6.2.2 各种质谱技术 质谱仪的一般结构框图如图6.1所示。质谱分析是一个制备样品 或从其他分析仪器引入样品样品气化并离子化引入样品离 子到分析器在分析器中按照离子的质荷比不同分离离子分 别检测各种离子并得到质谱图的过程。,图

9、6.1 质谱仪器组成示意图,质谱仪的核心是离子源和分析器，其他的部分一般 根据离子源和分析器相应地配备。 离子源多种多样，工作在真空状态下的有：电子轰 击源(electron bombardment, EB)、化学离子源 (chemical Ionization, CI)、真空火花源(spark source, SS)、激光表面解析源(laser desorption, LD)等；工作 在低压下的有辉光放电离子源(glow discharge, GD)； 工作在大气压下的有电(离子)喷雾(electron/ion spray, E/IS)、电感耦合等离子体源(inductively coupl

10、ed plasma, ICP)等。,分析器类型主要有：磁偏转、四极杆、离子阱、 飞行时间、离子回旋共振等。 不同的分析器与离子源之间有多种组合，构成了 质谱仪器庞大的家族。 二维质谱：两种不（相）同类型的质谱串联在一 起可形成二维质谱。例如Q-TOF MS, QQ-TOF MS, TOF-TOF MS以及MSn等。 二维质谱在提高分析灵敏度、通量等方面具有特殊 的优点，是蛋白质组大规模筛选的首选工具。,6.2.3 大分子电离技术 由于生物样品的非挥发性、热不稳定性及相对分子质量大等特性， 使传统的电子轰击(EI)、化学离子源(CI)等电离技术的应用受到 极大限制。随着FAB、MALDI、ESI

11、、ISI、大气压下碰撞电离 (APCI)等电离技术的出现，大大提高了质谱的测定范围，改善了 测量灵敏度，并在一定程度上解决了溶剂分子干扰等问题，使质 谱在生物分析中的应用得到进一步的发展。,表6.1 生物质谱电离技术比较,目前用于生物大分子质谱分析的软电离质谱技术如下： 电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS); (2) 基体辅助激光解吸电离质谱(matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry, MALDI-MS)； (3) 快原子轰击质谱(f

12、ast atom bombardment mass spectrometry, FAB-MS)； (4) 离子喷雾电离质谱(ion spray ionization mass spectrometry, ISI- ISI-MS)； (5) 大气压电离质谱(atmospheric pressure ionization mass spectrometry, API-MS)； (6)解吸电喷雾电离质谱(desorption electrospray ionization mass spectrometry, DESI-MS)。,6.2.4 基体辅助激光解吸电离,MALDI离子源可以电离分子质量为1

13、00-1000000Da的生 物分子并用于质谱分析，提供了高的灵敏度、高的离子 透过率和强的可操作性。MALDI之所以得到发展，得 益于早期试验用激光解吸及等离子体解吸生物有机分子 的成功，也得益于FAB生物基质的进展。1990s在日本和 德国几乎同时报道了60000Da分子质量的蛋白质的电离， 引起全球的关注和兴趣，并刺激了许多公司致力于开发 相关质谱仪，并研究如何用MALDI技术分析蛋白质、 多肽及DNA。,MALDI是1988年由Hillenkamp 和Micheal Karas等首 先提出的，其原理同FAB类似。它利用激光束照射分 散于基体中的样品，由于这些基体（质）能够强烈吸 收激光

14、，从而保护了样品分子。,图6.2 MALDI技术原理示意图,激光光束的能量首先被基体中的发色团吸收，随后这些 基体迅速蒸发为气相，被包含的样品分子被带入气相， 而离子化的产生是由于受激的基体分子将质子转移给样 品分子。这样离子被引入质量分析器，测量m/z得到质 谱图，并提供其离子同位素的分布信息。 MALDI-MS的实验参数包括： 基体和基体/分析物，激光功率，波长，脉冲宽度及记录 模式(正离子或负离子)。 N2激光由于在UV段(337nm)有较好的性能，而被广泛应 用于MALDI仪器中。,MALDI中的基体起着如下几种重要作用： （1）基体相当于样品分子的溶剂，样品分子被基体 彼此分开，从而

15、消弱了样品之间的相互作用； （2）基体分子从脉冲激光中吸收足够的能量，隔离 样品分子，提供光激发的酸或减基团，以及在离子- 分子碰撞中电离样品分子。,选择MALDI的基体主要要求如下： (1) 对激光有高的吸收系数； (2) 与样品能够溶于同一种溶剂中； (3) 具有真空稳定性； (4) 对普遍存在于生物溶液中的无机盐及缓冲液等 污染物具有包容性。 常用的基体有： 芥子酸(SA)，2,5-二羟基苯甲酸，咖啡酸，吡臻酸， 安息香酸，尼古丁酸等。,MALDI-MS在基体选定后，准备样品的方法有两种： Tanaka法：1987年 Tanaka等把待测的生物样品溶于甘油中，并与很细的金属粉 末混合，然

16、后把悬浮液滴到探头上，让激光照射，再进入质谱分 析。灵敏度10-9 mol数量级。 (2) Hillenkamp法：1988年 Hillenkamp等认为激光解吸时是底物吸收激光，提出了“ 基体辅助激光解吸”的概念。将烟酸和生物样品混合溶液滴到 探头上，干燥后，用激光照射，即可得到生物分子离子信号。 灵敏度10-12 mol数量级，且信号强，信噪比高，被广泛采用。 问题：为什么Tanaka获得了Nobel 化学奖，而非Hillenkamp?,MALDI的优缺点： 优点：对样品要求低，能耐高浓度盐、缓冲剂 和其他非挥发性成分。高灵敏度，样品量只需 要1pmol，甚至更少。 缺点：大质量离子检测较

17、困难。离子型表面活 性剂和低挥发性溶剂干扰严重，和其他进样技 术联用困难等。,MALDI可以与不同类型的检测器相互结合，特别是 飞行时间质谱(TOF)，即MALDI-TOF质谱！,图6.3 The Agilent Pulsed Dynamic Focusing MALDI (PDF-MALDI),图6.4 MALDI-TOF-MS的实际图,MALDI-TOF MS中样品离子化,将TOF谱图转化为常规 谱图,图6.5 The MALDI-TOF Spectra for Poly(Propylene Glycol),摘自：Anal.Chem., 2004,76,1532-1536. Richard

18、 B. van Breeman et al,图6.6,6.2.5 大气压电离质谱方法,API-MS指在大气压下使样品有效地电离并引入与质谱的 接口，再进行质谱分析。 API-MS的工作模式：(1) 电喷雾(ESI)；(2) 气动辅助电喷 雾(又称离子喷雾, IS)；(3) 大气压碰撞电离(APCI)；（4） 解吸电喷雾电离质谱(desorption electrospray ionization Mass spectrometry, DESI-MS)。 API-MS 可以测定的分子 质量范围是100100000Da，精度很容易达到飞克级至皮 克级的绝对灵敏度，可适用的化合物的范围非常广泛。可

19、与四极杆、离子阱、飞行时间质谱等组合。可与许多进样 技术兼容，如FIA, HPLC, CE等。,API-MS的四种工作模式的特点： 电喷雾(ESI)：离子化过程应用电场来产生带电液滴，然后 通过离子蒸发将分析物离子送入MS分析。 气动辅助电喷雾：具有上述电喷雾的特点，但最初的液滴 形成是由辅气(如N2)帮助雾化的结果。 大气压化学(碰撞)电离：利用一种气态化学反应，气体溶剂 (如CH4)作为化学离子源来电离样品。 (4) 解吸电喷雾电离 DESI)：是在2004年所發展出來的新电离法。 利用探針產生帶電液滴，接著利用高速氮氣流的攜帶來撞擊 分析物表面，而從分析物表面所形成的離子再進入質譜儀 作

20、分析。,电喷雾的电离机理,图6.7 电喷雾原理示意图,电喷雾的电离机理,小分子离子蒸发机理：在喷针针头与施加电压的电极之间形成 强电场该电场使液体带电，带电的液体在电场的作用下向带相 反电荷的电极运动，并形成带电的液滴，由于小雾滴易分散， 比表面增大，在电场中迅速蒸发，结果使带电雾滴表面单位面 积的场强度高达10 x108 V/cm2，从而产生液滴的“爆裂”。重 复该过程，最终产生分子离子。 (2) 大分子带电残基机理：首先也是电场使溶液带电而离子化，结 果形成带电雾滴，带电的雾滴在电场作用下运动并迅速去溶， 溶液中分子所带电荷在去溶时被保留在分子上，结果形成离子 化的分子。,ESI电离的一个

21、主要特点是可以在大气压下蒸发样 品，离子化过程温和，产生碎片极少，是一种软电 离方法。ESI通常可以得到多电荷分子离子，这对 于测量大分子意义重大。由于大分子可以带10100 以上电荷，因此，其质荷比大大降低，可用普通质 量测定范围的质谱仪进行生物大分子分析。,图6.8 电喷雾离子化过程示意图,电喷雾的一般理论,ESI放电电压(V0)与表面张力(Ts)、毛细管半径( r)及 针尖与采样板间距离(h)的关系可用下式表示：,(6.1),在实验中虽然并不用它来进行计算，但却可以定性地 帮助理解电喷雾的条件。,ESI产生多电荷离子，在电离过程中，喷雾中颗粒带 电荷数q为：,(6.2),式中：表示溶液的

22、表面张力常数 o表示介电常数 rs表示液滴的半径 电喷雾离子一般每多1000相对分子质量可以多带一 个电荷。,影响ESI过程的因素 由于电喷雾过程非常复杂，影响因素有： 离子化与否主要与被分析分子的pKa值和溶液的 pH有关； (2) 喷雾状态与表面张力和黏度有关，另外，与是否 有气动辅助喷雾也有关(喷雾量较大时)； (3) 去溶好坏与干燥气体的温度和流量有关，并与溶 剂的蒸发热Hvap有关； (4) 离子的解吸与它的溶解热(气态)有关； (5) 气相反应与质子亲和势和电荷交换速度有关。,ESI电离的优点： 被检测分子变成气相离子时没有受到外部能量的激发，因 而不会发生裂解，没有碎片峰，因此谱

23、图解析相对简单； (2)对于多级质谱，通过碰撞诱导裂解（CID）可以产生碎片， 从而提供分子的结构信息。电喷雾质谱不仅能够产生多电荷离 子、对某些极性物质电离效率高（对蛋白质接近100 %），而 且具有软电离等特性，因而成为极性化合物（包括溶液中的离 子），热稳定性差和高分子量化合物分析最有效的工具之一。 (3)在常规电喷雾电离技术中，喷雾过程容易形成较大液滴，液 滴中的样品分子不能完全离子化，因而降低了样品的利用率和 质谱检测灵敏度。近几年发展起来的纳升电喷雾方法 (Nanospray)，采用内径为10 m左右的喷针，样品注入到喷针 的喷口，在喷口前端产生喷雾，喷雾液滴比常规电喷雾产生的 小

24、100倍，这样可以使样品被充分利用，并有效离子化。与常规 电喷雾电离技术相比，Nanospray流量极低，样品消耗量极少， 灵敏度可以达到fmol。,图6.9 电喷雾质谱仪,图6.10 典型的电喷雾质谱图,6.3液相色谱质谱联用,作为化学领域最强有力的分离分析技术之一，自上世纪70年代以 来，液相色谱(LC)，特别是高效液相色谱（HPLC）得到了迅速 的发展，无论在色谱基础理论，还是在仪器性能方面都得到了很 大程度的提高和完善。随着应用领域的不断拓展， LC在环境分 析、生化分析、医药分析和药物质量控制等方面的应用也越来越 广泛，尤其是随着生命科学研究的不断深入， LC已经成为一种 极为重要和

25、必不可少的分离分析手段。 LC虽然在复杂样品分析中显示出很高的分离效率，而且定量准 确，但其定性分析能力却较为薄弱，通常仅仅是根据各组分的 保留特性来定性，这在复杂样品分析中，尤其在未知组分的定性 分析中具有一定的难度（可信度差和无标准品）。,6.3.1 概述,然而，随着一些新的定性分析手段的出现，尤其是质谱仪器的 发展，对一些组分相对简单的样品进行定性分析已经变得比较 容易。 质量是物质的固有特征之一，质谱分析中，表现为不同荷质比 的化合物对应不同的离子谱峰，由此，根据质谱分析结果可以 获得被分析物的分子量，从而实现对各物质进行定性分析，另 外，离子谱峰的强度与其所代表的化合物含量有一定关系

26、，所 以，利用这一点可以对各物质进行半定量分析。 质谱分析虽然具有灵敏度高、鉴别能力强等优点，但是由于离 子抑制效应等的影响在复杂样品定性分析中却具有一定困难。 由此可以看出，如果把LC分离和质谱分析有机结合起来，充分 发挥它们各自的优点，取长补短，就可以有效的对复杂样品进 行定性和定量分析，因此， LC -质谱联用技术逐渐被广大科研 工作者所关注。,液相色谱-质谱联用技术的研究始于20世纪70年代， 90年代以后，由于大气压电离技术的出现和成功 应用以及质谱本身的发展，液相色谱与质谱的联 用得到了极大的重视和发展。液相色谱-质谱联用 技术将液相色谱的高分离效能和质谱的高灵敏度 及较强的结构解

27、析能力有机的结合在一起，样品 经过液相色谱分离后，借助质谱分析结果进行鉴 定，开辟了复杂样品分离和检测的新天地。,串联质谱（MS/MS，Tandem MS, MSn）技术是 质谱分析中的重要联用技术，不仅可以给出样品 分子量的相关信息，而且还可以给出有关样品结 构的丰富信息。串联质谱（MS/MS）技术包括三 个过程：即用来进行质量分离的第一级质谱 （MS1），碰撞活化离解和用来进行质谱检测的 第二级质谱（MS2）。其中碰撞活化离解是使运 动中的离子和中性惰性气体进行碰撞、继而发生 碰撞活化离解的过程。,另外，液相色谱与单级质谱联用（LC-MS） 虽然已经具有足够高的灵敏度，但是仅能提 供分子量

28、信息，而液相色谱与多级质谱联用 （LC-MS/MS）则可提供分子结构的信息， 此外，通过MS/MS的选择反应控制模式 (SRM) 或多反应检测模式(MRM)可以提高 信噪比，在复杂样品分析时仍可达到很高的 灵敏度。,6.3.2 液相色谱-质谱联用接口技术,例如HPLC与MS接口的主要问题（1）HPLC流出物如果全部 气化，可产生5001000 mL/min的气体，而MS采样仅能接受 1050 mL/min的气体；（2）通用的气相电离方法一般不适用 于HPLC分离后的化合物（具有热不稳定性、极性和较高分子 量）。 为实现液相色谱与质谱的联用，需要解决液相色谱流动相对 质谱工作条件的影响的问题，为

29、此可以通过以下两个途径实 现： 一是发展不同接口以协调LC和MS的不同要求； 二是改进液相色谱技术，如发展微柱液相色谱，减少进入质 谱流动相的量，改进质谱的离子化方法，使它们两者之间逐 渐靠近。,液相色谱-质谱联用的实现，接口技术一度成为其发展 的瓶颈。在接口研制方面，前后共发展了20多种技术， 其中主要有直接导入接口（DLI）、移动带接口 （MB）、热喷雾接口（ES）、粒子束接口（PB）、 和快原子轰击（FAB）等，但这些技术都不同程度的 存在一些方面的限制和缺陷。近几年来，随着一系列 质谱软电离技术的实现和发展，尤其是随着大气压离 子化接口(API)技术和基体辅助激光解吸离子化接口 （MA

30、LDI）技术的不断成熟和完善，液相色谱-质谱 联用技术不仅得到了突破性的进展，而且在生命科学 中的应用也得到了前所未有的拓展。,理想的LC-MS接口应具有如下的特点： （1）高效率的样品转移，可接受的样品转移精度； （2）可适应不同的LC方法； （3）可适应不同的质谱操作条件； （4）样品在转移过程中不被分解损失； （5）高速、方便可靠，对操作人员的技术要求不高。,6.3.2.1 大气压离子化接口技术,大气压离子化接口是指离子化在常压下进行的 接口，是目前液相色谱-质谱联用技术中应用 范围最广的一种接口。API主要包括电喷雾电 离（ESI）和大气压化学电离（APCI）两种 操作模式。,该电离技

31、术利用位于一根毛细管和质谱仪进口间的电 势差生成离子，在电场的作用下产生以喷雾形式存在 的带电液滴，当使用干燥气体或者加热时，溶剂蒸发， 带电液滴体积缩小，电场增强，离子向液滴表面移动 并从表面挥发，最终生成单电荷或多电荷去溶剂化离 子。通常情况下，小分子生成M+H+或M-H-单电荷 离子，生物大分子产生多电荷离子。,图6.11 电喷雾电离 接口示意图,图6.12 大气压化学电离接口示意图,是将化学电离原理延伸到大气压下进行的一种新的软电离技 术。样品溶液从LC流出，进入具有雾化气套管的毛细管后， 被氮气流雾化，然后在通过加热管时被气化，气化后的溶剂 分子在加热管端的电晕放电探针处形成反应气等

32、离子体，样 品分子通过与反应气等离子体进行质子交换被电离，形成准 分子离子M+H+或M-H-，最后，样品分子的准分子离子通 过筛选狭缝进入质谱仪，整个过程在大气压条件下完成。,APCI（大气压化学电离）也是一种软电离接口 技术，电离过程中只产生单电荷峰，非常适合 弱极性小分子化合物的测定，另外，APCI还与 高流量的梯度洗脱和高低水溶液变换的流动相 兼容，通过调节离子源电压，可以得到不同断 裂程度的质谱图。,无套流CE-ESI 接口,nLC-ESI 接口,Z喷雾ESI源,图6.13 直接将CE与ESI-MS连接的 接口设计,6.3.2.2 LC与MALDI接口技术,LC与MALDI的联用目前正

33、在发展中，从离子化 的原理看，存在一些实际困难！,作为分离科学领域中最强有力的分离分析工具之一，液相色谱对 组分相对简单样品的分离采用一维分离模式完成，但是对于一些 组分复杂的样品而言，如果仅采用一维色谱分离模式，无论怎样 优化色谱分离条件，也无法使所有的组分都能达到满意的分离。 Davis等曾经指出: 只用一维分离方法对含有100个随机分布组分 的样品进行分离，完全分离其中的82个组分大约需要四百万理论 塔板数。显然，期望具有如此之高柱效的色谱柱在目前看来是不 切合实际的。而与一维色谱相比，近几年来得到迅速发展和广泛 应用的多维液相色谱(Multidimensional high-perfo

34、rmance liquid chromatography，MDLC)不仅能够提供更大的峰容量，而 且还具有分离样品动态范围宽、分辨率高和自动化程度高等优点， 它的出现不仅很好的解决了复杂样品的分离分析问题，而且大大 提高了液相色谱的分离能力和选择性。因此，多维液相色谱与质 谱联用也越来越被重视并得到迅速发展，所以，根据联用体系中 液相色谱的维数多少，液相色谱-质谱在线联用技术又可以分为一 维液相色谱-质谱在线联用模式和多维液相色谱-质谱在线联用模 式。,图6.14 多维液相色谱分离模式 2D-SEC-RPLC-MS; (b) 多维 蛋白质识别技术,SEC尺寸排阻色谱 RPLC反相色谱,图6.1

35、5 全二维液相色谱-质谱联用装置原理示意图,图6.16 川芎甲醇提取液的二维分离色谱图,6.4电化学光谱联用,电化学技术主要涉及电流、电势和电量的变化，在工农业和日 常生活中发挥重要作用(葡萄糖传感器和各种电池)，但采用电化 学技术很难得到物质结构方面的信息。因此，有必要将电化学技 术和其他方法进行联用。 与电化学技术联用的方法最常见的是各种光谱学技术。这些技术 分为现场(in situ)和非现场(ex situ)方法。现场方法是在控制电势 或电流时考察电解池溶液中的电极表面；在采用非现场技术时， 电极是从电化学池中拿走，然后进行测量，经常是在空气或真空 中进行。 在此主要讨论现场方法。,6.

36、4.1 与紫外和可见光谱联用,图6.17 透射光谱电化学实验装置示意图,光透电极(optically transparent electrode, OTE),A 透射实验,图6.18 (a)用于半无限扩散实验的透射光谱电化学池。光束从 垂直方向通过；(b)光透薄层体系：正视和侧视图。,图6.19 采用在SnO2 OTE电极上 产生甲基紫精自由基的电量滴定 细胞色素c和细胞色素c氧化酶。,在溶液中，一个甲基紫精自由基 可还原细胞色素c中的一个血红素 或细胞色素c氧化酶中的两个血红 素中的一个。实验结果表明细胞 色素c氧化酶中的一个血红素基团 首先被还原，然后甲基紫精自由 基在还原细胞色素c氧化酶

37、中的第 二个血红素之前，还原细胞色素c 中的血红素。,6.4.2 与振动光谱的联用,A 红外光谱 在红外光谱电化学(infrared spectroelectrochemistry, IR-SEC)中， 被探测物质在电极表面和距电极表面很薄的溶液层中。常用的外 反射模式如图6.20所示。,IR辐射,窗口,薄溶液层,图6.20 红外光谱电化学的外反射示意图,图6.21 IR-SEC的光谱电化学池,由于大多数溶剂对红外辐射有较强的吸收，所以窗口和电极之间 的溶液薄层必须很小(1-100 nm)。为了得到有用的信号，通常采 用对电势或入射光进行调制。电势调制红外技术称为EMIRS，即 电化学调制红外

38、反射光谱法(electrochemically modulated infrared spectroscopy)。,图6.22 EMIRS实验的仪器方框图 振荡器改变电极电势，并且为相敏检测器(PDS)提供一个参比信号。检测器调制的 IR信号也反馈到PDS。,大多数现代IR光谱仪具备Fourier变换的多种优点。相应的IR-SEC 技术是SNIFTIRS，即差减归一化界面Fourier变换红外光谱法( Substractively normalized interfacial Fourier transform infrared spectroscopy)。,图6.23 SNIFTIRS仪器的

39、方框图 光源、干涉仪、检测器和数据存取通常与一个商品化的FTIR仪器相同 引自 J.K. Foley, C.Korzeniewski, J.L. Daschbach and S. Pons, Electroanal.Chem., 14, 309(1986),图6.24 在不同的波数区域和在1mol/L HClO4溶液中对-二氯苯 在Pt电极上的SNIFTIRS光谱图。 每条曲线是在0.2 V和0.4 V(相对于NHE)处记录的光谱的差值。负峰相应于在0.4 V处 的特征主峰，正峰相应于在0.2 V处的特征主峰。,B 拉曼光谱 拉曼光谱提供与IR光谱互补的分子振动信息。由于激发和测量均 在可见光区，电化学池可采用玻璃窗和水溶液(两者均对红外有强 吸收)。拉曼散射的概率取决于一些确定的选择规律，但在大多数 情况下是很低的，因此实验必须采用强光源和较高的样品浓度。,图6.25 具有激光激发和电荷偶合装置(charge-coupled device, CCD)作为检测器的Raman光谱仪的方框图。,当分子吸附在特定的表面(例如银或金)时，拉曼效应可以得到 很大的增强，据此所发展的方法称为表面增强拉曼光谱