天然药物化学北京大学第三.ppt

1、色谱分离法色谱法(chromatography ) :一种分离、鉴别复杂混合物的有效方法。 最近，广泛应用于天然物有效成分的分离纯化。 对于一些性质相近、结构相似的化合物的分离，经典的溶剂法和结晶法不能达到分离的目的，使用色谱分析法法可以得到良好的分离效果。 按照色谱分析法的分离原理可分为吸附色谱法、分配色谱、离子交换色谱、大孔吸附树脂法、凝胶色谱分析法、高速液相色谱法、气相色谱法等。 吸附色谱法(adsorption chromatography ) :利用同一吸附剂对混合物中各成分的吸附能力的差异，达到分离各成分的目的的一种色谱分析法方法。 本方法特别适用于脂溶性中分子量成分的分离。 各吸

2、附剂表面存在吸附活性，对于不同的有机化合物在吸附剂表面显示不同的吸附能力，是吸附色谱法分离不同物质的基本原理之一。 吸附力的强弱由吸附剂和被吸附物的性质决定。 在一定的溶剂体系中展开后，在溶剂和混合物中，各成分会竞争吸附剂的活性表面，从而产生吸附和解吸的过程。 由于解吸的成份和溶剂始终具有竞争吸附作用，一旦被吸附剂吸附，一旦开始吸附和解吸过程，就一定会贯穿整个色谱分析法过程，直到色谱分析法结束。 由于化合物的结构性质不同，展开剂的洗脱能力和对吸附剂的吸附解吸性能也不同。 因此，在吸附剂上移动的距离不相同，各种成分相互形成程度不同的分离，性质差异越大，分离效果越好。 分离吸附色谱法的效果取决于吸

3、附剂和被分离物质的性质。 通常使用的吸附剂为硅凝胶(silica ) :一多孔性物质，为微酸性，其吸附能力比氧化铝稍弱，可以用通式SiO2XH2O表示。 氧化铝(aluminium oxide ) :是常用的吸附剂之一，由于氢氧化铝是直接在高温下(约600 )脱水制成，制造关系始终具有微盐化学基性，因此最适合分离植物中的盐化学基性成分如生物碱，如醛、罂粟碱等商品名为棉尼龙、尼龙。 分离类黄酮类、酚类、醌类、有机酸和鞣质的效果极好，性质极为相似。 并成功地分离出了生物碱、萜类、甾类化合物类、糖类、氨基酸诱导体及核苷类. 活性炭(activated carbon ) :一种非极性吸附剂，具有较强的

4、吸附能力，特别适合分离水溶性物质。 吸附色谱法的操作方式通常有薄层色谱法和列色谱分析法。 薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC ) :一种快速、简便、灵敏的分离检测方法。 薄层色谱法将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，将欲分析的样本点加入薄层中，用合适的溶剂展开，以达到分离、鉴定和定量的目的。 该方法不仅在天然产物成分的分离鉴定中发挥着独特的作用，而且在分析化学、药物化学、染料、农药等领域得到广泛应用。 薄层色谱的操作主要包括制板、点样、展开和显色4个方面。 柱色谱分析法(column chromatography ) :也是天然产物成分研究中常用的色谱分析法方法，实

5、质上是薄层色谱法的另一种形式。 其分离原理、吸附剂和洗脱剂的选择与薄层色谱法相同。 不同之处在于，柱色谱分析法将分离材料均匀地加入到一定规格的玻璃柱中，用适当的洗脱剂洗脱，分离结构性质不同的成分。 由于柱色谱分析法分离的样品量多，因此，通常为调制性分离。分配色谱法：利用物质互不相容的两相溶剂中分配系数不同进行分离的色谱法。 基本原理：其基本原理来源于两相逆流萃取法。 但是，将相互饱和的一相溶液吸附在某种惰性固体粉末或滤纸上的相称为固定相，吸附该固定相的称为支持剂(载体或载体)。 被分离的物质放置在固定相上，在另一个相即流动相中溶出(或展开)，试料中的物质在固定相和流动相之间分配分离。 因此，分

6、配色谱由载体、固定液相、移动液相、被分离物质4个部分组成。 支持剂：作为分配色谱的支持剂均为中性多孔粉末，无吸附作用，不溶于两相溶剂，不与被分离物质发生化学反应。 能够吸附一定量的固定相，流动相不改变组成就能够自由通过。 常用的支持剂有硅凝胶、硅藻泥、细胞里肌肉粉、滤纸等。 溶剂体系：分配色谱中的固定相和流动相统称为溶剂体系。 操作方式：分配色谱法的操作方式有纸色谱、分配薄层色谱和分配柱色谱等。 a .纸色谱(paper chromatography，PC )是以滤纸为支撑剂，在一定量的溶剂体系中展开，分离样品的平面色谱分析法。 b .分配薄层色谱法：分配薄层色谱法的原理与纸色谱分析法相同，装

7、置和操作与吸附薄层色谱法相同，只是铺地板用的吸附剂而非支撑剂。 c .分配柱色谱分析法：装置和吸附柱色谱分析法。 将吸附了固定相的支持剂放入柱中，将样品溶解于少量的固定相，放入柱上端，用流动相脱洗，分别采集。 离子交换色谱(ion exchange chromatography，IEC ) :使用络离子交换剂代替吸附剂的色谱分析法法。 该方法工业用途广泛，在天然产物有效成分的分离中，尤其是水溶性成分氨基酸、肽类、生物碱、有机酸和酚类化合物的分离，比在先更为方便。 a、基本原理：络离子交换树脂是一种具有特殊性能的高分子化合物，它们不溶于水、酸、碱和有机溶剂，但可以在水中解离成络离子，其解离出的络

8、离子与溶液中的其它络离子可逆交换，不影响自身结构。 由于与多个络离子亲和性不同，因此可以分离不同的络离子。 根据交换络离子的性质，可分为阳络离子交换树脂和阴络离子交换树脂。 离子交换色谱的原理是阳络离子交换树脂： RSO3-H Na Cl- RSO3- Na H Cl-阴络离子交换树脂： RN OH- Na Cl- RN Cl- Na OH-其中的r是树脂母体。 天然产物中的某些成分可以络离子化，有些成分不能络离子化。 能够络离子化的成分在水溶液中与络离子交换树脂反应而被吸附，不能络离子化的成分在水溶液中与络离子交换树脂不反应，不被吸附，相互分离。 b .操作方法：离子交换色谱的操作方法与列色

9、谱分析法基本相似。 最好是安装柱前的树脂预先用蒸馏水使一盏茶膨润，同时缩小树脂的粒度范围。 否则，柱内上下树脂的粒度不同，会影响分离效果。 使用过的树脂可以反复进行再生处理，一般采用酸碱再生处理法将盐型转换为游离型。 大孔尺吸附树脂(macro-reticular resine ) :广泛用于天然物的分离。 对抗生素和水溶性天然物成分的精制等显示出独特的作用。 a .性能和分离原理：常用的大孔吸附树脂不含交换化学基，是具有大孔结构的高分子吸附剂。 一般为白色颗粒状，粒度多为2060目。 理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，不受无机盐类存在的影响。 通常可以分类为非极性和中极性2种，在水溶液中

10、的吸附力强，具有良好的吸附选择性。 大孔吸附性树脂是由吸附性和选择性原理组合而成的分离材料，因此与络离子交换、树脂、凝胶分子筛不同。它所具有的吸附性是范德瓦尔斯引力和氢键吸附的结果，筛选性分离由其多孔网状结构决定。 要分离的天然物成分，根据其分子体积的大小和吸附力的强弱，在一定规格的大孔吸附树脂中用适当的溶剂洗提分离。 影响分离的因素有分子极性大小、分子体积、PH值等。 c .树脂柱的清洗：化合物被树脂柱吸附后，树脂表面或内部残留很多非吸附性成分或吸附性杂质，这些个的杂质在清洗过程中应尽可能清洗。 非吸附性成分可以用水冲洗，但是吸附性杂质可以根据情况，用低浓度的醇溶液，例如30%以下的乙醇等冲

11、洗，或者进行小的尝试寻找合适的洗涤溶剂。 d .洗脱液的选择：洗脱液可以使用甲醇、乙醇、丙酮、冰乙酸乙酯等，根据吸附力的强弱选择不同的洗脱剂。 溶出剂极性越小，无极性大孔吸附树脂的溶出能力越强。 在中极性大的孔中吸附树脂和极性大的化合物时，最好使用极性大的有机溶剂。 可设置若干不同浓度的溶出来确定最佳洗脱剂浓度，以实现满意的效果。 清洗速度控制在0.55ml/(cm2min )为宜。 洗提时，根据情况，也可以使用极性梯度不同的洗脱剂洗去各自不同的成分。 凝胶色谱分析法(gel filtration chromatography，GFC ) :一种发展为六十年代的分离分析技术。 其设备简单容易操

12、作，结果准确。 本技术发展为天然物化学和生物化学研究的常规分离方法。 常用的凝胶有联盟凝胶(Sephadex G )、聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel P )、琼脂凝胶(Sepharese，Bio-Gel A )等，其中，被广泛使用的是右旋糖酐凝胶。 a .性能和分类：右旋糖酐凝胶是右旋糖酐(右旋糖酸无水物)和甘油通过醚交联键相交的多孔性网状结构物质。 商品凝胶是干燥颗粒状物质，使用前必须在一盏茶中膨胀。 由于右旋糖酐分子含有大量的羟基化学基，因此具有一定的极性，在水中膨胀为凝胶粒子。 不溶于水和盐溶液，在碱性和弱酸性的溶液中保持稳定，强酸中到高温可以水解作用部分糖苷键。 右旋糖酐凝胶网眼大小是

13、影响分离效果的主要因素。 在制备时添加不同比例的交链剂，可以得到交链度不同的凝胶。 交链度越大，网状结构越密，网眼越小，吸水膨胀越大，可用于分离小分子量物质，相反，交链度越小，网眼越大，可用于分离大分子量物质。 商品凝胶的型号一般按交链度的大小进行分类，用每克干燥凝胶吸水量的10倍的数值表示。 例如，G-25型凝胶表示为每克吸水2.5ml的葡萄糖凝胶。 右旋糖酐凝胶LH-20(Sephadex LH-20 )是通过向右旋糖酐凝胶G-25的分子中引入羟丙基化学基而不是分子中的羟基化学基上的氢而获得的新凝胶。 由于其分子内引入了亲脂性化学基，不仅具有亲水性，也具有一定的亲油性，极大地拓展了凝胶色谱

14、分析法的应用范围，既可以用于强极性水溶性化合物的分离，也可以用于水难溶性或某些亲油性化合物的分离。 b .分离原理：葡萄糖吸水形成凝胶粒子，其链式反应骨架中存在许多网格。 网眼大的只能放大分子量的化合物，网眼小的只能放小分子量的化合物。 因此，超过一定限度的大分子物质被排出到凝胶粒子的外部，难以进入网眼内部。 由此，能够进入凝胶内部的化合物分子和不能进入凝胶内部的化合物分子，根据分子的大小进行筛选，被称为“分子筛”。其基本原理如下图所示，o :代表凝胶粒子o :代表大分子物质1 .被分离物质位于库托格拉夫床表面2 .样品进入库托格拉夫床，小分子进入凝胶粒子内部，大分子与溶液一起流动3 .大分子

15、物质的行程短，从库托格拉夫床出来因此，以多成分进行凝胶色谱分析法分离时，从柱中流出的顺序按照分子量减少的顺序排列。 然而，有些凝胶并非全部失活，溶质与右旋糖酐凝胶之间也形成了特殊的吸附作用。 用右旋糖酐凝胶LH-20(Sepha-dex LH-20 )分离游离态的类黄酮类化合物时，主要是由于吸附作用，酚性羟基化学基多的化合物的吸附力大，难以溶出，酚性羟基化学基少的吸附力小，而用相同规格的凝胶分离黄酮苷时，分子筛是主导作用c、应用：凝胶色谱分析法目前广泛应用于天然产物有效成分的分离纯化工作，是水溶性高分子化合物的分离常用方法之一，实践证明其对分离小分子量物质也有效。 随着新凝胶材料的诞生，凝胶色

16、谱分析法的应用范围也在不断扩大。 高效液相色谱法(highperformanceliquidchroma-tography，HPLC ) :一种新发展的液相色谱法。 由于高效填料和各种敏锐检测器的出现和发展，该方法在分离效率、分析速度、检测灵敏度和自动化等方面达到了新的领域，形成了独特的体系。 随着计算机技术的迅猛发展，促进了新型高速液相色谱法的产生，云同步与高速液相色谱法、质量、核磁、红外等光谱技术的联用技术也取得了长足的进展，是对复杂混合物的分离与分析非常有用的方法。 近年来，高效液相色谱在天然产物成分研究、有机化学工业、环境化学及高分子工业等方面得到广泛应用。 特别是在天然物成分的鉴定、

17、含量测定及结构类似成分的分离中显示出其重要性。 喜树盐化学基中抗癌活性成分的分离：喜树为萨尔托科乔木，从该植物中分离得到的含有内酯环结构的生物碱为抗肿瘤活性成分。 下图为用高速液相色谱法从喜树中分离得到的4种喜树盐化学基的类似物。 采用了以薄薄的壳多层小球ODS柱为固定相，以55%甲醇水为流动相的反相系统。 此时，极性大的试料成分(羟基喜树盐化学基)保持时间短，先溶出，极性小的试料成分(脱氧喜树盐化学基)保持时间长，最后从柱中溶出。 气体色谱法(gas chromatography，GC ) :是分离、分析现代天然产物的重要手段。 随着其分离检测技术的日益完善，它已成为石油化学工业、药物代谢、毒分析及环保监测不可缺少的检测工具，对天然药物研究前景广阔。 挥发油是具有较强大姨妈活性的天然产物，沸点低，具有易挥发特性，因此气体色谱法特别适合其分离分析。 中药成药多为复方制剂，缺乏有日子、明确标准特罗尔其内在质量，近年来用气体色谱法定量测定中药的定性、主要成分，特罗尔其内在质量，方法简单可靠。 气体色谱法技术鉴别药材的真伪优劣，对临床血药浓度监测、药物代谢动力学及药效学等方面的研究起着促进作用。 近年来，随着气体色谱法技术作为分离手段、将质量分析装置作为分析工具使用，大型GC-MS协作装置具备计算机微处理系统，使数据处理自动化、迅速