植物基因组的提取

1、植物基因组DNA的提取，纯度和含量的测定，实验8，1部分，植物基因组DNA提取，1，实验目的和要求1，学习和掌握植物基因组DNA的提取原理和方法。2、了解琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作。3.学习和掌握对传记游泳检查基因组DNA结果的初步分析。其次，实验基本原理植物基因组DNA提取方法主要针对提取原理，有两种茄子：乙酰三乙基溴化铵(CTAB)方法和十二烷基硫酸钠(SDS)方法。十六烷基三甲基溴化铵及十二烷基硫酸钠等离子表面活性剂，细胞膜和核膜蛋白溶解，核蛋白融合，使DNA能够逸出。添加酚类和氯仿等有机溶剂，蛋白质变性，萃取液分相，核酸(DNA，RNA)水溶性强，离心后可以从萃取液中去除细胞碎

2、片和大部分蛋白质。在上清液中添加无水乙醇，沉淀DNA，将DNA沉淀到TE溶液中，就可以得到植物基因组DNA溶液。植物的二次代谢产物多酚化合物可以介导DNA降解，多糖的污染也是影响植物核酸纯度的最常见问题，因此可以抑制限制酶、连接酶、DNA聚合酶等分子生物学酶的生物活性。传统的CTAB-DNA提取方法步骤多，麻烦，DNA生产率低，苯酚难以完全去除，因此很容易影响以后酶切等工作的效率。SDS方法操作简单、温和，能提取高分子量DNA，但结果产物糖类杂质较多，直接影响DNA限制性核酸内切酶消化效果。植物细胞均质化有多种酶(尤其是氧化酶类)对DNA提取产生不利影响，因此提取缓冲液中应加入抗氧化剂或强还原

3、剂(如巯基乙醇)，降低这些酶的活性。本实验采用十二烷基硫酸钠(SDS)方法提取植物基因组DNA，提取基因组DNA，然后使用琼脂糖凝胶电泳情感基因组DNA分子量大小，纯度。用紫外线吸收法测定基因组DNA纯度和含量。DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定： DNA分子对琼脂糖凝胶有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的溶液中带负电荷，在电场中向阳极移动。在一定电场强度下，DNA分子的移动速度取决于分子筛效果，即相对分子量DNA段游泳速度不同的分子筛效果。DNA片段在凝胶中用低浓度荧光染成染料溴化B (EB)，然后在紫外线下可以看到橙色红色带，在凝胶中可以确定DNA片段的位置。影响DNA游泳速度(移动速

4、率)的因素是DNA分子质量的影响。双链DNA分子迁移速度与DNA分子量代数成反比。分子量越大，迁移率越小。DNA组成的影响：超螺旋DNA线DNA开环DNA胶浓度的影响：浓度越低，相同核酸分子移动得越快，常用凝胶浓度为12。电场强度的影响：电场强度越高，带粒子的游泳速度越快。但是，由于凝胶的有效分离范围随电压的增加而减少，因此传记神童通常使用低压，(普通5V/cm)(电场强度)。大型传记游泳的情况下，0.51.0V/cm传记英灵也将熬夜。在进行高压传记风洞时，只能使用聚丙烯酰胺凝胶。EB的影响：溴化B (EB)插入双链DNA，导致负电荷减少、刚性和长度增加。传记电泳缓冲液的影响：核酸传记灵动经常

5、使用TAE、TBE、TPE三个茄子缓冲系统，但各有优缺点。TAE价钱便宜，但缓冲能力低，必须进行阳极缓冲液循环。TPE在回收DNA时，DNA污染了磷酸盐，影响后续反应。所以多使用TBE缓冲液。在缓冲液中加入EDTA，可以将二价离子合并，抑制DNase，保护DNA。缓冲液pH经常是碱性或中性的，此时核酸分子带负电，向两极转移。碱基组成和传记游泳温度的影响一般不大，在DNA提取过程中，(1)DNA的二级结构和双链容易受到江珊、江珊、加热、低盐浓度、有机溶剂、酰胺、元素等多种茄子因素的影响，从而抑制了双链释放(2)内部和外部源DNase的活力。DNase就像把大分子的DNA切成片的刀，为了根除它，可

6、以用A、低温操作等多种茄子方法来完成。b，调整pH以形成偏碱(pH 8.0)；c、在提取物中添加表面活性剂；d，加合剂(EDTA)去除酶的辅助因子(Mg2)，使酶活性丧失。(3)防止化学分解。可以分解DNA，如过酸、过碱和其他化学因子，一般综合考虑，最好采取pH8.0左右。(4)防止物理因素的分解。温度过高或机械张力剪切等DNA分子特别大，容易被机械张力打断，在细管里稍微急促的流也可能折断DNA，所以提取过程中要特别注意牙齿点。操作过程应尽量简单温和，减少搅拌次数，避免剧烈晃动。大卫亚设，北美国电视电视剧，季节)(5)植物中的二级代谢物质(主要是细胞质中的多酚或色素化合物)，妨碍核酸的提取。(

7、。因此，一般尽可能选择嫩代谢旺盛的新生组织作为提取DNA的材料。这是因为年轻新生组织的次要代谢物质较少，DNA含量高，易碎，植物材料最新鲜。(阿尔伯特爱因斯坦，美国电视电视剧，健康)，3，实验材料和试剂1，实验材料：植物嫩叶2，实验试剂(1)基因组5)RNA提取缓冲液(2)氯仿3360(9) 3mol/L NaAc (10) 5TBE缓冲(11) 6传记电泳父缓冲(12) 1.0%琼脂糖凝胶(13) EB，(14) DNA分子量段宜恩：3，4、恒温水浴箱65 5，制冰机；6、冰箱7、恒温水浴箱37；8、微波炉；9、传记电泳装置和传记电泳槽；10、紫外线检测仪。5，实验操作方法及程序，65预热后

8、的研究体，加入一些石英砂。放入65预热后的核酸提取缓冲液3ml，提取植物的嫩叶0.5g，快速均匀研究，转移到7ml盖离心管的65水浴保温1hr，经常轻轻摇动3ml氯仿-异丙醇-乙醇溶液，记录体积，沉积，*，添加等体积异丙醇试剂，混合后20min沉淀DNA，4离心5，000g3 min收集，3mlTE，65水浴中15min融化，完全溶解，加入等体积，在新的7ml离心管中记录体积*，完全挥发和以1mlTE沉淀的酒精包括植物基因组DNA溶液*、凝胶电泳检测基因组DNA(分子量大小纯度)、4保存大气，说明：如果蛋白质和RNA没有清除干净，就有酚、苯酚/氯仿、氯仿提取阶段和继续，(a)植物基因组DNA提

9、取，*植物基因组DNA提取过程现象，*植物基因组DNA提取过程现象，1，将胶(琼脂糖1 01g琼脂糖放入250毫升锥虫病中(阿尔伯特爱因斯坦、美国电视电视剧、美国电视电视剧、成功) (注：EB是引诱剂、致癌物，接触凝胶必须戴手套操作)2DNA含量低，可以按上述比例增加样品量，但总体积不能超过样品槽容量。每次添加样品，都要换枪，防止对方污染。注意上样品时，注意操作，以免凝胶受损或样品槽的底部凝胶穿孔。3.传记神童完成后，盖上传记泳具盖，立即开机，将电压调节为100V，恒压传记神童。溴酚蓝带从凝胶前边缘移动约2厘米，停止传记影动(约3060min)。4.观察和摄影将胶水取出，放在紫外线灯下观察。在

10、DNA存在的地方，展示肉眼能分辨的橘色荧光带，再用录像机拍照，便于分析。(注：紫外线对眼睛有害。观察时戴防护眼镜或眼镜，或隔着玻璃或有机玻璃观察。)，(b)琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA，第2部分，基因组DNA纯度和含量测定，1，实验目的和要求1，学习紫外线吸收法，测定核酸的基本原理和方法。2.学习和掌握紫外线吸收法，测定基因组DNA纯度和含量的方法。第二，实验基本原理核酸DNA和RNA中包含的碱基的苯环结构(嘌呤环和嘧啶环)的共轭双键具有紫外线吸收的性质，它们具有260nm中最大的吸收棒。因此，可以用260nm波长测定核酸含量。波长为260nm时，DNA或RNA的光密度大小不仅与总含量不同，

11、而且与它们的其他结构也不同。对于标准样品，浓度为1g/ml时DNA钠盐的OD2600.02。在OD2601中，双链DNA含量约为50g/ml单链DNA含量约为37g/ml RNA含量约为40g/ml寡核苷酸含量约为30g/ml(因为气质不同)1，核酸样品DNA，RNA含量测定：10 H2O稀释DNA或RNA含量测定当DNA(g/l)=50OD260读数DNA样品稀释倍数/1000RNA (G/L)=40o0 DNA样品包含蛋白质、苯酚或其他小分子污染物时，影响DNA吸光度的准确测量。DNA有260nm最大的吸收棒，蛋白质有280nm最大的吸收棒，盐和小分子集中在230nm。因此，通常同时检测同

12、一样品的OD260、OD280、OD230，并计算其比例，以确定核酸样品的纯度。2、判断核酸样品纯度的一般标准：DNA纯度：OD260/OD2801.8，用纯DNA标记OD260/OD280 1.9表明存在RNA污染。OD260/OD280 1.6表示有蛋白质、苯酚等污染。RNA纯度：1.7 OD260/OD2802.0，标记为纯RNA od 260/od 280 1.7表示存在蛋白质或苯酚污染。OD260/OD280 2.0指示可能存在异类硫氰酸残馀。OD230/OD260的比率必须在0.4-0.5之间，高比率表示残留的盐和小分子(例如核苷酸、氨基酸、苯酚等)的存在。样品不纯的话，比率就会改

13、变，不能用分光光度法核酸定量。也会影响酶和PCR的效果。，三，实验材料和试剂1，实验材料植物基因组DNA样本2，实验试剂ddH2OTE缓冲区(pH 8.0)。四、实验器材和仪器1、离心机、离心管(5ml)和离心管框架2、微型吸管10ul、200ul、1000ul和总头部；3、紫外分光光度计；4、石英有色盘(0.5厘米光光)或1厘米光光的微量石英有色盘(50ul，100ul)。5，实验操作方法和程序方法1:吸收提取的植物基因组DNA样本230nm，添加到新的5ml离心管，加入一定量的ddH2O或TE缓冲(pH 8.0)，稀释100倍，用0.5cm光光石英有色盘(需要约1.6ml样品溶液)稀释。计算植物基因组DNA样品溶液的DNA含量和DNA样品的纯度。方法2:直接提取植物基因组DNA样品微量原液(12ul)，用分光光度计自动测定230nm、260nm、280nm的吸光度值，计算植物基因组DN