干扰素制备的工艺流程ppt课件.ppt

1、干扰素的制备过程，1，干扰素，什么是干扰素？概念(干扰素，IFN):由免疫细胞产生的一类细胞因子，是一组具有相似结构和相似功能的生物调节蛋白，由免疫细胞在机体受到病毒感染时通过抗病毒反应产生。根据分子结构和抗原性的不同，可分为四种类型：等。干扰素根据其结构分为1b、2a、2b和其他亚型。区别在于单个氨基酸的不同。早期，病毒诱导干扰素产生人白细胞，产量低，价格昂贵，不能满足需要。现在它可以通过基因工程技术生产并在大肠杆菌中发酵和表达。2、基因工程菌的制备、目标基因的分离、通过将目标基因克隆和重组到大肠杆菌K12克隆载体中在体外培养重组受体细菌、从受体细菌中获得目标基因并将重组质粒表达载体筛选到大

2、肠杆菌受体细菌中(表达和稳定性的检测)、工程菌、3、4、目标基因的分离和获得、将重组体导入宿主细胞、重组质粒的提取、质粒DNA的纯化、 目的基因和克隆载体的体外重组，从大肠杆菌K12中获得目的基因，检测重组质粒和提取目的基因，目的基因和表达载体的结合和导入，工艺流程，5，目的基因的分离和获得，设计用于合成干扰素基因的引物(完全的)，每个引物优选在内部或5-末端具有内切核酸酶位点。 1.药物诱导细胞，如佛波酯，增加干扰素在细胞中的表达。2、破碎细胞，提取总基因，3、4、5，用逆转录试剂盒进行逆转录，将总基因逆转录成基因，以基因为模板和干扰素引物进行聚合酶链反应，得到干扰素基因的完整聚合酶链反应产

3、物，6、目的基因与克隆载体体外重组，1。载体(质粒、病毒等)的提取。)、双消化和干扰素基因3的聚合酶链反应。在序列被鉴定为正确(无义突变也是可接受的)后，将其引入受体细胞，进行筛选，并将重组体引入宿主细胞。将该基因克隆到含有四环素和氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，并转化到大肠杆菌中。在一定条件下将重组载体DNA分子转化到大肠杆菌中，形成携带质粒的菌株。为了从大肠杆菌K12中获得目的基因，有三种基本的质粒重组方法，即：目的基因与克隆载体重组、目的基因片段与目的基因片段重组、克隆载体与克隆载体重组；此外，基因突变可能发生在重组过程中。质粒PBR322或重组质粒的菌落可通过将细菌包被在含有氨

4、苄青霉素的培养基上获得。在步骤2，步骤：步骤1中获得的每个单个菌落被标记为甲、乙、丙、丁等。从每个菌落中选择一些细菌，并转移到含有四环素的培养基中。大多数含有重组质粒的细菌和少数没有重组质粒的细菌单菌落可能发生突变而无法生长。原因：由于PBR322含有四环素抗性基因，重组质粒中的靶基因被插入到四环素抗性基因中，破坏了其结构，失去了四环素抗性。9、提取重组质粒。1.将在前面步骤中获得的含有目标基因的大肠杆菌扩增，并在含有氯霉素的培养基中培养15小时。前人的实验证实大肠杆菌K12在生长前6h是一个缓慢期，对数增长期为615。5h，稳定期15。5 19.5h和下降期19。5小时后。氯霉素：可以抑制宿

5、主的蛋白质合成，从而阻止细菌染色体的复制。然而，松散的质粒可以继续复制。2.细菌的收获和裂解1)用合适的旋转头以4000转/分钟的速度分离心脏15分钟，弃去上清液，打开离心喷嘴，倒置离心管，使上清液完全流动。2)将细菌沉淀重新悬浮在用冰预冷的100毫升STE瓶中。Se 0.1mol/l氯化钠10mol/l tris。如步骤1)所述，将1摩尔/升乙二胺四乙酸(ph 8.0)离心以收集细菌细胞。，10，3，碱裂解方法1)将洗涤过的500毫升培养物的细菌沉淀重新悬浮在来自收获细菌的步骤3的10毫升(18毫升)溶液中。溶液：50毫摩尔/升葡萄糖，25毫摩尔/升三。氯化钠(pH 8.0)，10毫摩尔/升

6、乙二胺四乙酸(pH 8.0)溶液可以分批制备，以101毫摩尔/平方英寸(6.895104帕)的蒸汽灭菌15分钟，并在4。2)加入1毫升(2毫升)10毫克/毫升的新溶菌酶溶液，并将其溶解在10毫升/升Tris中。Cl(Ph8.0)。当溶液的酸碱度低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。3)加入20毫升(40毫升)新制备的溶液。溶液：0.2毫升氢氧化钠(使用前用10毫升储存溶液稀释)，1%十二烷基硫酸钠关闭瓶盖，慢慢倒置离心瓶几次，使内容物充分混合。在室温下放置5-10分钟。提取重组质粒，11，提取重组质粒，4)加入15毫升(20毫升)冰预冷的溶液。溶液：5毫升/升醋酸钾、60毫升冰醋酸、11.5毫升水

7、和28.5毫升。配制的溶液为3毫升/升钾和5毫升/升醋酸。密封瓶口，摇动离心瓶几次，使其内容物混合均匀。此时，两个不同的液相应该不再出现。放在冰上10分钟，形成白色絮状沉淀。在0储存后形成的沉淀应包括染料脱氧核糖核酸、高分子量核糖核酸和钾-十二烷基硫酸钠-蛋白质-膜复合物。5)用合适的旋转头以4000转/分钟的速度将中心分开15分钟，在不制动的情况下自然停止旋转头。如果细小的细菌碎片没有紧紧地粘附在壁上，它们可以再次以5000转/分钟的速度离心20分钟，然后将上清液尽可能地转移到另一个瓶子中，并丢弃留在离心管中的粘性液体。未能形成致密沉淀通常是由于溶液和细菌裂解物混合不充分。6)将上清液过滤至

8、250毫升离心瓶中，加入0.6倍体积的异丙醇，充分混合，并在室温下放置10分钟。12，提取重组质粒，7)用合适的旋转头在室温下以5000转/分钟分离核心15分钟，并回收核酸。如果在4下离心，盐也会沉淀。8)小心倒出上清液，打开瓶口，倒置离心瓶，排出残留的上清液，室温下用70%乙醇冲洗沉淀管壁。倒出乙醇，用分批真空装置吸出附着在瓶壁上的所有液滴，室温下将瓶子倒置在纸巾上，使残留的微量乙醇完全挥发。9)用3毫升(pH8.0)溶解核酸沉淀。10)净化。(1)用聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA)将核酸溶液转移到15毫升的试管中，加入用冰预冷却的3毫升5毫升1/升氯化锂溶液，混合均匀，在4下以10，000转

9、/分钟的速度分离心脏10分钟。硅可以沉淀高分子核糖核酸。2)将上清液转移到另一个30毫升的离心管中，加入相同量的异丙醇，混合均匀，在室温下以10，000转/分钟的速度用44号旋转头(或其等效的旋转头)分离核心10分钟，并回收沉淀的核酸。3)小心取出上清液，打开喷嘴，将试管倒置，使最后剩余的液滴流出。在室温下用70%的乙醇清洗沉淀物和管壁，沥干乙醇，用连接有真空装置的Bachder吸管吸走管壁上附着的所有液滴，打开喷嘴，将管倒置，放在纸巾上几分钟，以蒸发残留的微量乙醇。4)用含有无脱氧核糖核酸酶的胰核糖核酸酶(20g/ml)的500微升TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到微型离心管中，并在室

10、温下放置30分钟。5)加入500升含13%(重量比)聚乙二醇(PEG8000)的1.6摩尔/升ACI，混合均匀，用微型离心机以12000克离心5分钟，回收质粒DNA。6)吸取上清液，用400微升TE(pH8.0)溶解质粒沉淀。使用苯酚，苯酚：氯仿，氯仿各1次。(7)将水相转移到另一个微型离心管中，加入100升10摩尔/升的乙醇铵，充分混合，加入2倍体积的乙醇(约1毫升)，在室温下放置10分钟，并在12000克下离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。8)吸取上清液，加入200升4，并在12000克离心2分钟。9)吸收上清液，打开喷嘴，将试管放在实验台上，直到可见痕量乙醇完全蒸发。10)将沉淀用50

11、0升TE(pH8.0)溶解，用TE(pH8.0)稀释，测量0D 260，计算质粒DNA的浓度(10D260=50g质粒DNA/ml)，然后将DNA储存在20下，纯化质粒DNA，15，检测重组质粒并提取目标基因，获得目标基因。获得目标基因和PBR322质粒片段。通过琼脂糖凝胶电泳，由于目的基因和PBR322质粒片段的相对分子量不同，在电泳过程中产生了不同的条带。通过与已知基因长度的比较，我们可以选择相应的靶基因，然后用气相色谱纯化柱回收纯化。具体而言，将含有目的基因片段的琼脂糖凝胶块在55下用3倍体积的特殊高盐溶液融化，然后将该DNA释放到水溶液中。然后，它通过加根纯化柱，经过“结合、洗涤和洗脱

12、”的步骤，直接获得纯化的脱氧核糖核酸样品。通过核酸探针杂交鉴定靶基因，16。目的基因与表达载体的结合和导入，表达载体：PBV220，经双消化处理，退火后连接，构建重组质粒，用氯化钙法导入宿主大肠杆菌，构建工程菌，在培养基中培养，通过干扰素性质鉴定目的工程菌，分离工程菌，扩大培养，提取质粒并分析质粒稳定性，17，干扰素发酵过程，种子制备，种子液发酵，粗提，精提，半成品制备，半成品鉴定，分装，冻干产品验证， 成品包装，18升菌种制备，取70保存的甘油试管菌种(工作种批)，室温下融化，然后放入摇瓶中，30培养，pH 7.0，活化182小时，然后测定吸光度和2。 种子罐培养：将活化后的菌株接种到装有3

13、0L培养基的种子罐中，接种量为10%，培养温度为30，酸碱度为7.0，串联调节曝气量和搅拌速度，控制溶解氧为30%，培养3-4小时，然后转移到发酵罐中，同时取发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，以控制杂菌。3.在发酵罐中培养将种子溶液引入装有300升培养基的发酵罐中，接种量为10%，培养温度为30，酸碱度为7.0。级联调节曝气量和搅拌速度，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20，pH6.0，溶解氧60%，继续培养5-6.5英寸。同时，对发酵液进行细菌检查。当0D值达到9.01.0时，用5倍的冷却水快速冷却至15以下，以减缓电池老化。或将发酵液转移到收集罐中，加入冰块，迅速将温

14、度降至10以下。4.细菌收集将冷却的发酵液转移至连续流离心机，并以16000转/分钟的速度离心收集。检测干扰素含量、细菌蛋白含量、细菌干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目。当细菌储存在20度的冰箱中时，不得超过12个月。每3个月检查一次活动。19、控制干扰素发酵过程，在假单胞菌属的发酵生产中。培养1.5小时，细胞分裂速度最快，3.5小时开始下降。然而，干扰素的快速合成在3.5小时后出现，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。可以看出，在发酵过程中，假单胞菌的生长。和干扰素的生产基本无关，因此可以采用两阶段培养策略进行过程控制。溶解氧控制在生长阶段和生产阶段分别采用最佳溶解氧浓度，以提

15、高干扰素的发酵水平。通风速率和搅拌速度可以级联调节。(2)假单胞菌生长的最适温度不同于产物形成的最适温度。将产物的合成温度控制在20可以有效防止干扰素-2b的降解，最佳生长温度为30。随着温度的升高，质粒的稳定性迅速下降，目标产物降解因此，在发酵的后期可以降低酸碱度，导致大量蛋白酶失活，减少干扰素的水解，增加干扰素的积累。(1)效价测定采用细胞病变抑制法，以维希细胞VSV病毒为基本检测系统，必须以国家或国际标准作为国际单位进行校准。(2)蛋白质含量测定：福林酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白质为标准。(3)比活性滴度的国际单位与蛋白质含量毫克数的比率。(4)纯度电泳纯度用非还原的SD

16、S-PAGE进行，银染应为单区，扫描仪测定的纯度应在95%以上。(5)相对分子量测定减少到SDS-PAGE，样品量不少于微克。同时，以相对分子质量已知的蛋白质标准系列为对照，以相对分子质量的对数为纵坐标，以迁移率为横坐标作图，计算相对分子质量。与理论值相比，误差不应超过10%。22，(6)残留外源基因含量的测定使用放射性核素或生物素探针法，每剂中残留的外源基因应低于100皮克。(7)残留血清lgG含量的测定当抗体亲和层析用作纯化方法时，必须进行该试验。(8)用于测定残留抗生素活性的半成品中不应存在抗生素活性。(9)半成品的光谱吸收值应通过紫外光谱扫描检查，最大吸收值应为2802 nm。(10)

17、用CNBr裂解法测定肽图，测定结果应符合干扰素的结构，且批次间应一致。(11)等电点测定等电聚焦电泳。(12)灭菌后的半成品应进行干扰素效价测试、无菌测试和热源质量测试。23。成品应经过验证。(1)添加注射用水后，具有物理性质的冻干产品的白色或黄色疏松体不应含有肉眼可见的不溶性物质。(2)鉴定试验采用酶联免疫吸附试验或中和试验。(3)水分含量应采用卡尔费休法测定，其应低于3%。(4)无菌检查与半成品相同。(5)热原试验与半成品验证相同。(6)干扰素效价的测定与半成品相同，效价不应低于标示量。(7)对三只重350-400克的豚鼠进行了安全性测试，每只豚鼠的皮下注射量是成人每千克体重临床使用的最大量的3倍。经过7天的观察，如果没有局部发红、坏死和豚鼠的整体重量没有下降，则成品合格。取5只重18-20克的小鼠，每