第五章：质谱法测定分子结构（二）大分子.ppt

1、1,有机质谱原理及应用,第五章：质谱法测定分子结构(II), 大分子,2,方法：ESI和MALDI两种电离方法。 对象：带有官能团的可溶解高分子。 1988年，Tanaka，最早报道聚乙烯醇(PEG)， 22,000。 1992年， Danis， MALDI， 聚丙烯酸和聚苯乙烯磺酸，30,000。 M. Karas (b) 油酸, m/z 281; (c) 亚油酸, m/z 279. 谱图采自于AutoSpec-OATOF仪器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞气体。,中能碰撞，400eV 特殊设计的仪器上实现，有较多的信息。,36,低能CID谱，M-Ht2Li+，(4,7,10,13,16,

2、19)-六烯二十二烷酸 (docosahexaenoic acid, m/z341)。,低能碰撞，400eV 信息较少，特殊情况使用。,37,5.3 糖类的质谱分析,糖：生命体的能源供给者，传统的认识。 糖的生物活性： 与蛋白质、脂质、磷酸脂结合成“糖复合物” (glycoconjugate)，血浆、酶、激素及细胞外膜均有含糖蛋白。糖复合物参与细胞的识别、增生、分异；维持生物体的免疫系统、生殖系统、神经系统和新陈代谢平衡。 寡糖和多糖具有增强免疫力，抗辐射、抗肿瘤活性，成为药物，中药应用，生物多糖，保健药物，保健品。 糖结构的复杂性： 单糖的组成为CnH2nOn (n=39)，其中n=5和6最

3、为常见。每个单糖有多个手性碳原子。有链式结构和环式结构。 寡糖和多糖的糖链是由含多元羟基的环状己糖或戊糖通过苷键连接而成。各羟基环上有顺反异构体，各单糖分子上有五个手性碳，连接的位置和构型多种多样。,38,糖类分析的困难性： 强极性，分离难，HPLC峰形不好。 连接方式复杂，立体化学复杂。 同系物多，糖苷键弱，复杂混合体系。 电离效率不高、种类有限。,16种单糖的常见结构,一、单糖及多糖的结构,39,9,葡萄糖醛酸 GlcA,10, 鼠李糖 L-吡喃鼠李糖 Rha,11, 乙酰神经氨糖酸 NeuNAc,12,胞壁酸 2-氨基-3-氧-(1-羧乙基)-2-脱氧-D-葡萄糖 Mur,14, 鸡纳糖

4、 6-脱氧- -D-葡萄糖,15, 泰威糖 Tyv,16, D-果糖 Fru,一个典型的双触角氮连接多糖的结构特征,触角,核心区,40,二、质谱分析 电离方式： FAB：传统的电离方法，主要集中于低聚寡糖的分析。 ESI：对于常规的ESI，天然多糖的电离不如肽和蛋白，纳升喷雾可以改善电离效率，可以达到与肽和蛋白相当的程度。寡糖的亲水性限制了ESI雾滴的表面活性，灵敏度低。纳喷雾雾滴小，可以突破亲水性的限制，灵敏度显著升高。多糖的衍生化，减小亲水性，可提高灵敏度，导致灵敏度提高的是表面活性的增加，而不是样品的挥发性。 MALDI：低聚物糖的电离效率基本与分子量无关。由于糖的不稳定性，MALDI电

5、离时会产生某些分解，尤其会产生亚稳离子分解，可以用源后解离(PSD)技术测定亚稳离子，但会使谱图变得复杂。,多糖碎片代号表示法 非还原端用A, B, C表示。 还原端用X, Y, Z表示。 左上角标表示，环中两根断裂键所连碳原子的编号(从环上氧原子开始计数，红色数字)，右下角的数字表示残基的序号。,41,42,43,44,Human Genome Project,5.4 核苷酸(Oligonucleotide)的质谱分析,Understanding The Genome To Fight The Disease Y2K Drug Design,45,500,600,700,800,900,10

6、00,1100,1200,m/z,0,5,10,15,20,25,30,35,40,45,50,55,60,65,70,75,80,85,90,95,100,Relative Abundance,919.1,915.4,1098.6,1102.9,787.8,1107.3,922.5,784.5,686.1,790.6,817.1,1147.9,689.1,851.6,691.7,956.7,609.9,1070.7,1064.7,905.3,768.7,617.3,1153.7,1061.7,720.3,959.3,664.8,901.7,1174.3,1040.0,590.0,549.1,

7、522.1,Negative Ion ESI Of 18 mer (200 fg/uL),进样速度： 3 uL/min 乙腈-甲醇-丙酮 (70:20:10,v/v/v, 5% TEA) 毛细管温度: 100 C,OLIGO22 # 209-213 RT: 1.96-1.99 AV: 5 NL:1.49E5 T: - p Full ms 450.00-1200.00,46,OLIGO22,#,217-225,RT:,2.03-2.09,AV:,8,NL:,1.63E5,T:,- p Full ms 450.00-1200.00,650,700,750,800,850,900,950,1000,

8、1050,1100,m/z,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,Relative Abundance,1102.9,1098.6,918.8,915.4,787.5,784.5,689.3,686.4,611.2,-5,-6,-7,-8,Negative Ion Charge States of 18 mer,47,0,10,20,30,40,50,60,70,80,90,100,Relative Abundance,5520.0,5498.0,5541.0,5565.0,5745.0,4788.0,5972.0,5579.0,5385.0,5017.0,5221

9、.0,4908.0,5116.0,6086.0,5762.0,6206.0,4821.0,GATTCGTAGCTACGAATC Reported Avg. Mol. Wt: 5500 Monoisotopic Mass: 5497.7,Negative Ion Deconvoluted Spectra,48,Negative Ion MS2 Spectra of the - 5 and -7 Charge States,49,5.5 蛋白质分析 一、氨基酸和小肽,小肽断裂碎片离子定义,50,研究小肽的结构：MS/MS分析 例：一个五肽的分析 具有保护基的五肽的一级结构： BOCGlyAlaDV

10、alLeuIleOBz BOC = t-Butyloxy carbony, Bzl = benzyl.,yn = yn,51,各离子的生成途径 MH-56+ McLafferty重排,MH-100+,52,bn系列离子,yn系列离子, yn = yn + 2,53,bn和yn系列离子生成的另一种机理,54,20种氨基酸残基（NH-HCR-C=O）和羟胺正离子的质量,55,500,600,700,800,900,1000,1100,1200,1300,1400,1500,1600,1700,1800,m/z,0,100,%,998.2,942.7,893.2,848.6,808.3,616.2,

11、771.5,738.0,617.2,1060.5,999.6,1131.1,1061.8,1211.8,1132.5,1137.5,1305.0,1413.7,1541.9,1696.3,16000,17000,18000,m/z,0,100,%,16951.4,去卷积 deconvolution,20 fmole 马心肌红蛋白 (Horse Heart Myoglobin) ESI 质谱图,二、蛋白质分析,56,原始数据,去卷积 混合物：主要两种,beta lactuglobulin,57,人血红蛋白 MALDI-TOF 质谱图,58,鸡蛋溶菌酶ESI质谱图,59,m/z1 = 895,m/

12、z2 = 945,肌红蛋白ESI质谱图,60,5.6 蛋白质组学及应用,什么是蛋白质组？ 由基因组，细胞或组织所表达的所有蛋白质成分。 蛋白质组的重要性 研究基因组功能的重要途径。 药物目标 - 在分子水平研究健康和疾病的相关。,蛋白质组学是一门在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其活动规律的新兴学科。 蛋白质组学的终极目标是测定生物物种的所有生命活动中的所有蛋白质。,Why蛋白质组学?,mRNA表达水平不能预测蛋白质表达水平 蛋白质的修饰和加工不能从基因序列直接推导 蛋白质组是动态的并反映生物系统的状态,61,蛋白质组学面临的挑战 蛋白质没有可进行量的放大方法(如DNR的PCR方法)。 在生物

13、处理过程中蛋白质是高度动态变化的。 物理化学性质的多样性。 动态范围的挑战：相对含量超过106范围(血清中可达1012),质谱测量在蛋白质组学中的作用 质谱是肽(不是蛋白质)的一级序列分析的最普遍和最有效的工具。 质谱是一种精确的定量工具，尤其是内标法定量(如对同位素比的 测量)。 质谱在确定蛋白质高级结构时不是很有效。 质谱对已知肽和蛋白质重复定量分析不是很有效。,62,经典的氨基酸序列分析方法 N端氨基酸单元的分析 最常用的有下列两种方法： 桑格尔(Sanger F)方法：利用肽链N端游离氨基与2,4二硝基氟苯(DNP)发生芳香亲核取代反应，而将 肽链上的氨基酸逐个分解。 埃德曼(Edma

14、n)方法：用异硫氰酸苯酯(PITC)和N端的 游离氨基反应，将肽链上的氨基酸逐个分解。 C端氨基酸单元的分析：通过羧肽酶催化水解 用特定的酶催化使含某种氨基酸的肽键部位水解 经典分析方法的缺点 工作量大、测序速度慢、样品用量大。,63,蛋白质的二维分离,64,仪器鉴定率 肽质量指纹谱 MALDI 50% (Peptide Mass Fingerprinter, PMF ) 多肽序列标签 LC/MS/MS 80% (Peptide Sequence Tag, PST) 从新测序LC/MS/MS 80% (De Novo) 蛋白质及混合物的定量分析： 同位素编码亲和标记 (Isotope-Code

15、d Affinity Tags, ICAT),蛋白质序列研究的三个层次,65,蛋白质组研究技术路线,样品(组织、细胞等),凝胶图象分析,蛋白质鉴定,二维数据库,酶解,HPLC-MS、MS/MS,数据库检索,二维凝胶电泳,酶解,肽混合物,MS、MS/MS,肽指纹谱,肽序列标签,从新测序,66,一、肽质量指纹谱(Peptide Mass Fingerprinter, PMF) PMF测定速度快。 PMF灵敏。 PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。,67,分离的酶解的蛋白质,96/384位样品靶,数据处理和数据库检索,质谱样品的准备,MALDI质谱分析,蛋白质一级结构结果,PMF方法的一般流程,

16、68,洗胶/去污 脱水 减少S-S键 洗涤/脱水,1、In-gel 酶切/消化,Multiprobe (4x96 Well Plat) 样品体积0.5-100 L 板上加热和冷却 消化板加热 37oC 肽存储在-4oC冷却板 酶试剂存储在-4oC冷却板,修正-SH基 加入trypsin溶液 5-12小时 肽提取,2、质谱分析样品的制备,灵敏度： 500fmoles BSA in-gel。 移液和消化时间8小时(1x96 well plat)。 最多可进行4x96 well plat的同时消化。,基本能力,69,3、质谱测定,设这检索的条件，不同软件有不同的参数和用法。,MALDI-TOF 质谱

17、测定,4、数据库检索,70,样品1,样品2,样品3,数据库检索结果： 带*号的峰为与数据库中的峰相匹配的峰。 样品1：甘油醛-3-磷酸脱氢酶 样品2：遍在蛋白羧酸基末端水解同工酶 样品3：丙糖磷酸异构酶,71,PMF 实验，同一点上经常是蛋白质的混合物,Some proteins are identified with high confidence,Some proteins are identified with high confidence,Some proteins are identified with low confidence,Row data,72,And there ar

18、e still peptides unassigned to a protein,Final result,73,74,二、多肽序列标签(Peptide Sequence Tag, PST)和肽阶梯序列(Peptide Ladder Sequencing),1、肽序列标签 蛋白质的常见氨基酸有20 种，一般3 个氨基酸的肽段碎片将有8000种可能的排列方式4 个氨基酸将有160000种排列方式，因此即使对于不是很大的原核生物的蛋白质组来说，一个短的序列片段也具有很高的特异性。 肽序列标签：一个多肽的部分氨基酸序列和该肽的质量以及该肽未测序部分的质量。,Mann M. et al, Anal.

19、Chem., 1994,66,4390 for PST Mann M. et al, Trands in Biochem. Sci., 1996,21,494.,75,例：马心肌红蛋白鉴定 马心肌红蛋白胰酶酶切产物的ESI-Q-TOF肽指纹谱,76,马心肌红蛋白胰酶酶切肽段m/z908.4(双电荷离子)的MS/MS谱图,肽序列标签：,GLSDGE WQQVLNV WGK,y10,1257.8,y3, 390.3,C端,N端,WQQVLNV W,Y3,390.3,y10,1257.8,检索结果：,77,N端 YAM IGD PTGALR C端,y10,1000.5,y7, 715.4,例： m/

20、z为691.43Da(M2+)，质量数为1380.6Da。 MS/MS图,肽序列标签： 检索结果：来自乙醇脱氢酶,715.4(DGI)1000.5,78,2、肽阶梯序列(Peptide Ladder Sequencing) 梯状测序法(ladder sequencing)：用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基，相互间差一个氨基酸残基的系列肽，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基，与Edman法相似。,AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn,PTC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -Aan PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -A

21、An,PITC + 5% PIC,ATZ(AA1) + AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn,Acid (TFA),after m cycles,Further cycles (without separation),PC-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC- AA2-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA3-AA4-AA5- -AAn PC-AA4-AA5- -AAn PC-AAm- -AAn,一步MALDI-MS,阶梯序列数据,B. Chait et al., Science 262, 89, 1

22、993.,原理：,79,血纤维蛋白肽:,Protein ladder Sequencing Glu1fibrinopeptide B,80,81,82,可选择性的碎裂方式： 光诱导解离(UV-193nm) 相当于高能CID。 多光子电离(IR-10.6m) 相当于低能CAD。 表面解离(SID) 相当于低能CAD。 电子捕获解离(ECD) c和z类型碎片增强。 注：这些方法在自动化大批量实验中并不是常规的方法。,数据库搜索为什么会失败 蛋白质不在数据库里或者不正确的搜索参数(酶特征，分类法等等)。 在数据库里蛋白质表达不正确(DNA核苷酸序列，基因内区序列等等预测失败)。 蛋白质变性. - 变

23、性的氨基酸残基 - N端和C端的变化：蛋氨酸的形成，序列信号变化，C链缩短 - 可变的序列(同族以及选择性结合的变体) - 后修饰变化(糖基化，磷酸化等) - 不希望的化学诱导修饰(在尿素中氨甲酰化) 搜索引擎不够完善成熟。,83,三、重新测序(De novo sequence),数据库中没有的蛋白质分析 样品来源于非序列化基因组 蛋白质经多重高度修饰 在实际生物体中，非同寻常的酶活性 处理古生物样本，样品处理时肽被修饰(污染) 合成肽,重新测序的原因,谱图的预处理 多电荷峰转化成单电荷峰 多同位素峰转化成担同位素峰 简化谱图提高信噪比,84,谱图处理,谱图分析,85,16O/18O C端标记

24、 为了提高对串联质谱数据的解读能力，尤其是对y和b型离子系列的辨别能力，用化学修饰方法使辨别更容易。 16O/18O C端标记：在蛋白质酶解时，酶解液中H218O和H216O各占50%，酶解后肽段羧基端上的羟基氧18O/16O的(M+2/M)同位素丰度比高于正常的峰强度，据此可以分辨出y系列离子。,给出C-端离子的唯一特征碎片离子,86,de novo 序列解释 马尔可夫链蒙特卡洛(Markov chain Monte Carlo) de novo 序列产生算法 贝叶斯规则(Bayesian)断裂方式和谱图匹配算法,Beta 牛乳糖 m/z 841.5 的MS/MS谱,87,m/z 841.5

25、 MS/MS 谱的测序结果,88,同位素亲和端: ICAT试剂，重氢和正常氢的样品。 细胞中蛋白质被还原后，分别用含重氢和正常氢的ICAT试剂与之作用， ICAT试剂标记蛋白质中的半胱氨酸的巯基。 将两份蛋白质溶液混合，然后用任何方法提取分离。 蛋白质用胰蛋白酶酶切。亲和色谱对肽分离。 用各种质谱方法(MS, MS/MS等)分析。 通过同位素比例进行定量分析，通过碎片分布提供鉴定信息。,四、同位素编码亲和标记 (Isotope-Coded Affinity Tags, ICAT),89,使用可分裂的ICAT试剂对蛋白质的定量和鉴定分析,MS Data,90,混合后胰酶消化,细胞状态一,细胞状态

26、二,提取蛋白，还原后用ICAT的轻链12C标记,提取蛋白,还原后用ICAT的重链13C标记,典型的ICAT试剂工作流程,91,基于稳定同位素标记定量的标记蛋白质方法 化学标记(ICAT,N末端,以及其他残留物末端) 优点：一般都能适用(组织结构，细胞等) 同位素富集的生长机理(15N) 不需要任何化学干涉, 但不能应用于组织样品，峰对之间的质量 差可变。 新陈代谢标记（12C精氨酸） 不需要任何化学干涉，但不能应用于组织样品。,92,五、蛋白组学方法的应用,1、生物的蛋白质组及其数据库 简单生物的蛋白质组：完全测定或大部分测定蛋白质序列，如细菌、支原体、酵母等。 相对复杂的高等生物：线虫、水稻、 小鼠及人类：局部或功能蛋白质组学。 相关的数据库的建立和完善。Langen建立了流感嗜血杆菌的双向数据库。 2、生物过程生理机制的研究 大肠杆菌中蛋白质折叠的过程中新生肽段与分子伴侣的作用：首先利用免疫共沉淀得到胞质中所有的与分子伴侣GroEL结合的肽链，然后用双向电泳等方法对这些肽链进行鉴定。 吞噬体的蛋白组分析: 140种蛋白，其在细胞吞饮/吞噬作用途径中的作用是以前人们所未曾预料到的。,93,3、蛋白质的相互作用 作为细胞蛋白复合物和传导途径的基本要素，蛋白之间的相互作用对蛋白的功能实现起着关键的作用。 用酵母双杂交系统研究线虫生殖器的发育过