第二节酶的分离纯

1、第三节 酶的分离纯化,酶的分离纯化,酶的分离纯化是指首先将酶蛋白与组织、细胞和培养基相分离，再除去其他一些可溶性杂质，最终获得与酶的应用相适应的酶制剂，或达到酶学研究要求的、有一定纯度的酶蛋白的过程。,一、酶分离纯化的一般原则,1、生物材料的预处理 2、混合样品的粗分离 3、粗分离样品的纯化 4、酶蛋白的浓缩干燥和保存 目的：提高酶的比活性。,1、生物材料的预处理,酶蛋白从组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原有的生物活性。 动物组织和细胞 捣碎机、匀浆器或超声波处理 植物组织和细胞 研磨或纤维素酶处理 微生物细胞 研磨、超声波处理、溶菌酶处理,2、混合样品的粗分离,一般采用盐析、等电点沉

2、淀和有机溶剂沉淀法。 分步盐析法,3 粗分离样品的纯化,（1）柱层析 （2） 层析介质的搭配 一般选择离子交换层析和亲和层析相 搭配 上样量大、转一性强、纯化倍数高。 （3） 酶蛋白的结晶,4、酶蛋白的浓缩干燥和保存,（1） 溶液的浓缩 减压浓缩 适用于不耐热的生物大分子 吸收法 利用PEG为吸收剂 超过滤法 利用分子大小不同分离,（2） 溶液的干燥 真空干燥 适用于不耐热、易氧化的生物大分子 冷冻干燥 升华干燥将固态溶剂气化除去,（3） 样品的保存,干粉保存 一般较稳定 液态保存 对酶活性不利 常用的防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿； 稳定剂有硫酸铵、蔗糖、甘油和金属离子。,酶分离纯化的一般过程：

3、,生物材料的预处理 混合样品的粗分离 粗分离样品的纯化 酶蛋白的浓缩干燥和保存,二、粗分离样品的分离纯化的原理：,1 根据分子大小纯化酶蛋白 2 利用溶解度分离酶蛋白 3 根据分子电荷纯化酶蛋白 4 根据蛋白质的选择吸收分离酶蛋白 5 根据蛋白质的亲和性质分离酶蛋白,1 根据分子大小纯化酶蛋白,（1） 透析 （2） 密度梯度离心 （3） 凝胶过滤（层析）,透析,透析是利用生物大分子不能通过半透膜的性质，使酶蛋白和其他小分子物质（无机盐、单糖等）分开；,透析法,密度梯度离心,酶颗粒在具有密度梯度的离心介质中离心时，当沉降到与其自身密度相等的介质密度的时候，就停止沉降，最后各种酶在离心管中被分离成

4、各自独立的区带。形成区带的酶可以在管低刺一小孔逐滴放出，分部收集。,密度梯度离心,(3) 凝胶层析,凝胶层析的原理： 当不同大小分子的酶蛋白混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网状孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠之外，随着溶剂在凝胶珠之间的孔隙向下先被洗脱下来，小分子物质后被洗脱下来。,凝胶过滤的介质的选择 葡聚糖凝胶(Sephadex G) 聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel) 琼脂糖凝胶(Sepharose) 琼脂糖和葡聚糖组成的复合凝胶(Superdex),是分子量从几万到几十万的葡聚糖通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质。可用于分离分子量1000500,000的分子。以商品Seph

5、dex G为例，G以后的数字为胶膨润时吸水量的10倍，如25就表示该胶物质每1g能吸水2.5m1，这个数字越大说明吸水量越高，孔径也越大，更适于分离较大的分子.,2 利用溶解度分离酶蛋白,（1） 利用等电点沉淀酶蛋白 （2） 盐溶和盐析 （3） 有机溶剂分级沉淀,盐析法是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。 盐析法的原理：球蛋白类在低的盐浓度溶液中，它的溶解度随盐的离子强度升高而增大，表现“盐溶”特性。但是当盐浓度继续升高，超过某一上限值时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析”沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。,（3） 有机溶剂分级

6、沉淀,与水互溶的有机溶剂能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。,有机溶剂在这个过程的主要作用： 降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子问的引力增加，溶解度降低。 有机溶剂的另一作用是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。,有机溶剂沉淀法应考虑的因素是： 温度 0以下，有机溶剂必须预先冷却 到-15-20 pH 靠近待纯化酶的等电点pH 离子强度 添加适当浓度的中性盐 有机溶剂 丙酮的分离效果一般最好,3 根据分子电荷纯化酶蛋白,（1） 电泳 （2） 离子交换层析,（1） 电泳,在外加电场存在下，利用分子携带的净电荷不同，达到分离分子混合物的一种试验技术或方法

7、。,电泳法主要分为：,醋酸纤维薄膜电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,醋酸纤维薄膜电泳,最简单的是膜电泳，它以滤纸、醋酸纤维素薄膜为支持物，简易快速，但分离量很低，只能用于蛋白质粗分析。,聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE),SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂，如二硫苏糖醇、-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶束

8、，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响，而迁移率只与蛋白质本身的分子量有关。,Native PAGE SDS-PAGE,双向聚丙烯酰胺凝胶电泳,双向电泳等电聚焦电泳(IEF-PAGESDS-PAGE,等电聚焦电泳 这是利用两性电解质载体(一种多乙烯多胺与丙烯酸加合反应得到的同系多异构体混合物)它们具有相近的pK值与pI值在电场作用下能形成连续平滑的pH梯度，待分离样品中各组份在电泳过程中，又能按照各自的等电点聚焦到相应的pH梯度位置上从而达到分离目的。,等电聚焦电泳,等电聚焦图

9、谱,双向电泳,双向电泳的结果,（2） 离子交换层析,基本原理: 利用离子交换树脂作为固定相的层析法。主要是基于被分离的物质的阳离子或阴离子与相应的离子交换剂间的静电结合能力的大小，即根据物质的酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和解吸附的作用，将溶液中的组分分离。 阳离子交换树脂：树脂O-.A+ +M+ =树脂O-. M+ + A+ 阴离子交换：树脂O-.D- +X- =树脂O-. X- + D-,Ion exchange chromatography,4 根据蛋白质的选择吸收,吸附层析 作为吸附剂的种类： （1） 无机类 氧化铝、活性碳、硅胶等。 （2） 有机类 淀粉、纤维素和酰胺凝胶等。,5 根据蛋白质的亲和性质分离酶蛋白,亲和层析：根据流动相中的生物大分子与固定相表面偶联的特异性配基发生相互作用，有选择地吸附溶液中的大分子而进行的层析分离方法。