第八章-病毒的遗传分析.ppt

1、第八章 病毒的遗传分析,本章重点: 以噬菌体为材料 1、分析基因的精细结构 2、基因定位与遗传作图,病毒（virus）既不属于原核生物，也不属于真核生物，属非细胞型生命形态，又称为分子生物。 其一般特点是： 个体极小：介于20300 nm之间，能够通过细菌滤器； 无细胞结构：仅含一种类型的核酸（或DNA或RNA），其主要成分是蛋白质和核酸； 没有完整的酶系和蛋白质合成系统，离体条件下，以无生命的化学大分子状态存在，可形成结晶，不能进行独立的代谢活动； 严格的活细胞内寄生，以复制的方式增殖； 对抗生素不敏感，但对干扰素敏感,通常按宿主类型病毒分为： 1. 噬菌体（bacteriophage 或p

2、hage）: 细菌病毒、真菌病毒及藻类病毒 2. 植物病毒(plant virus): 感染高等植物、藻类等真核生物的病毒 3. 动物病毒：昆虫病毒和脊椎动物病毒,8.1 病毒的形态结构与基因组 8.1.1 病毒的形态结构 病毒的形态结构只能借助电子显微镜才可以观察到。成熟的具有侵染力的病毒个体称为病毒粒子（毒粒），病毒粒子是一种包括核酸和结构蛋白或被膜的一个完整的病毒颗粒，其体积大小相差悬殊，绝大多数直径在10300 nm之间。其形态多种多样，但基本形态有杆状，如烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）呈直杆状，腺病毒（adenovirus）呈球形，蝌蚪状为大部分噬菌

3、体的典型形态，如噬菌体和T偶数噬菌体均为蝌蚪形（图81）。,基本结构 核心 + 衣壳（核衣壳） 核心：DNA或RNA 衣壳由许多蛋白质亚单位衣壳体以对称的形式，规则排列而成。 有的病毒在核衣壳外还有囊膜、包膜、被膜、外膜等结构，膜的表面还有突起：刺突、囊膜粒等。,8.1.2 病毒的基因组 已知病毒基因组的结构类型多种多样，根据病毒基因组的结构、以及其转录mRNA、指导蛋白质合成与病毒复制表达的特点，基本上可以将其分成6种类型： 双链（ds）DNA病毒基因组 单链（ss） DNA病毒基因组 正链（+）RNA病毒基因组 负链（-） RNA病毒基因组 双链（ds） RNA病毒基因组 反转录病毒基因组

4、,不同病毒的核酸含量差别较大，通常在1% 50% 。 但对每种病毒粒子而言，核酸的长度是一定的，一般由5500 kb组成。 最大的病毒基因组有几百个基因 最小的病毒如M S2噬菌体仅有3个基因 病毒基因组编码的基因一般有：侵染功能所需的基因，如侵染中的酶；基因组复制所需的基因，如聚合酶基因；病毒体形成的基因，如衣壳蛋白基因；破坏宿主细胞的基因，如溶菌酶基因；有些病毒生活周期中任何特殊方面所需的基因，如噬菌体基因组与宿主基因组之间的位点专一性重组所需的基因等。,8.2 噬菌体的增殖与突变型 8.2.1 噬菌体的增殖 （1）烈性噬菌体（virulent phage）的增殖:感染宿主细胞后就进入裂解

5、反应，使宿主细胞裂解。 整个过程包括：,吸附 侵入 脱壳 生物合成 装配和释放,（2）温和噬菌体的增殖,其感染周期有两种途径：即裂解途径和溶源途径， 分别称为裂解周期（lytic cycle） 和溶源周期（lysogenic cycle）,8.2.2 噬菌体的突变型 （1）条件致死突变型 在某些条件下，导致某些突变型致死。那么这些条件就称为限制条件，而在另一些条件下仍可进行增殖，从而得以扩增进行研究，所以这些条件称为许可条件。 温度敏感突变（temperature sensitive mutation，ts），野生型噬菌体能在很大的温度变化范围内感染宿主并进行繁殖，而热敏感突变型（heat s

6、ensitive mutant，hs），通常在30（许可条件）感染宿主进行繁殖，但在4042（限制条件）就是致死的，不能形成噬菌斑；而冷敏感突变型（cold sensitive mutant，cs）在较低温度下就致死。 抑制因子敏感突变（suppressor sensitive mutation，sus），sus突变的实质是原来正常的密码子变成了终止密码子，因而翻译提前终止，不能形成完整肽链而产生有活性的蛋白质。带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因（suppressor，su）（许可条件）的宿主菌时能产生子代，但在感染另一种没有抑制基因（su）（限制条件）的宿主菌时，不能产生子代。野生

7、型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。,根据在带有专一性抑制基因的宿主中的非致死性，可以将sus突变分为3类：琥珀突变（amber，amb）、赭石突变（ochre，och）和乳白突变（opal，op），它们相应的密码子为UAG、UAA 和UGA,终止密码子不编码任何氨基酸，称为无义密码子（nonsense codon），是蛋白质合成的终止信号。这些密码子是琥珀型（amber ）UAG、赭石型（ochre）UAA 和乳白型（opal ）UGA。如果编码多肽链中某一氨基酸的密码子突变为终止密码子，多肽链合成到此便会中断，从而使多肽链变短而失去活性。这种突变称为无义突变（nonsense mutati

8、on）。各种无义突变都是条件致死突变，因为有相应的无义抑制基因（su）。 这些sus突变型之所以在带有相应的抑制基因宿主中可产生后代，是因为翻译过程中，在终止密码子处插入一个特定的氨基酸，防止在终止密码子位置上提前终止。如琥珀突变就有许多种抑制基因，各插入某个氨基酸以防止提前终止（表8 -3）。,携带su突变型的菌株实质是tRNA基因发生了突变，例如表83中的琥珀型抑制基因su3在UAG密码子上插入了一个酪氨酸，这是因为tRNATyr基因的反密码子的一个突变，tRNATyr正常的反密码子是GUA，它按摆动规则译读酪氨酸密码子UAuc。su3菌株的tRNATyr含有反密码子CUG，它识读琥珀型密

9、码子UAG，并插入酪氨酸而防止终止。即使抑制基因可在相应的终止密码子处插入一个特定的氨基酸而防止提前终止，但合成蛋白质的量也只有相应野生型的5% 55%（表83）,（2）噬菌斑形态和宿主范围的突变型 噬菌斑形态突变型 这类突变往往是致死的，受控制的基因大都位于基因组中狭窄的特定的区段里，而噬菌体大多数基因都涉及生命过程不可缺少的功能。但突变后有的是由于侵染宿主细胞后溶菌速度的快慢而形成大小不同的噬菌斑（plaque）。另一些则是由于被感染细菌全部或是部分被杀死而形成清晰或混浊的噬菌斑。 一般说来烈性噬菌体（ virulent phage） ，如T2、T4以及 X174等形成清晰噬菌斑（ cle

10、ar plaque） ，而温和噬菌体（ temperate phage） ，如 和P1等则形成混浊的噬菌斑（ turbid plaque）。,宿主范围的突变型 噬菌体感染细菌时，首先吸附于细胞表面的专一受体上，这是由受体的基因控制的，如果受体发生改变，有可能使噬菌体不能附着，从而该噬菌体的宿主范围就缩小，另外，噬菌体突变也可以扩大寄生范围。尽管这些突变通常是致死的，不能形成噬菌斑，但有些突变在限制的宿主中是致死的，而在许可的宿主中则可形成噬菌斑。因而宿主范围的突变型其本质也是条件致死突变型之一。 Benzer所用的T4的r 突变就是一个条件致死突变型。,T4 r 突变使所侵染细胞迅速裂解形成大

11、的噬菌体，即快速溶菌突变体（ rapid lysis mutant） ，这些突变体命名为r，所以称为r 突变型。T4噬菌体有多个迅速裂解突变型，分别称为r ， r ， r 等，它们位于T4染色体DNA的不同区段，这3组突变型由于在大肠杆菌不同菌株上的反应不同可以相互区别（表8- 4） 。,8.3 噬菌体突变型的重组测验,8.3.1 Benzer的重组测验与基因的精细结构分析 噬菌体的杂交和重组慨念 野生型噬菌体 突变型 用两种突变型噬菌体感染同一宿主细菌，叫混合感染（mixed infection）或双感染（double infection）进入裂解周期两个噬菌体偶然地发生交换它们的后裔可以出

12、现重组子。 因此可以进行染色体作图分析。,(2)基因的精细作图基因内重组 （Intragenic recombination) 基本原理如图所示:,虽然基因内重组能够发生，但实验很难做，因为在两个相同基因内的两个突变间的距离非常短，在这样一个极其小的区域，产生重组染色体的可能性仅1105。真核生物如果蝇、植物这样低的频率是无法从实验上得到的。r突变型品系，在E.coli中的不同表型提供了一个实验系统，可以检测到1106的重组子。,1955年Benzer：细菌噬菌体遗传区的精细结构 1、分离两个不同的（非互补的）r噬菌体突变子 2、共感染E.coli B，形成噬菌体的新群体，E.coli B细胞

13、逐渐裂解。 3、收集裂解液，和E.coli K菌株混合后倒在固体平板上 4、取一些噬菌体 稀释到108，感染E.coli B，也取一些噬菌体稀释到103，感染E.coli K12 () 5、涂布细胞，观察噬菌斑的数目,Benzer利用T4的两个r不同突变型如r47和r104在许可条件下进行双重感染，即r47和r104同时侵染大肠杆菌B菌株，形成噬菌斑后收集溶菌液，将此溶菌液等分两份，一份再接种大肠杆菌B菌株，在大肠杆菌B菌株的细胞中r47、r104、r47r104、都能生长，故在此平板上可统计噬菌体总数；另一份溶液接种于大肠杆菌K（）菌株中倒平板，在这里，只有重组子才能生长（图8-4），由于r

14、双重突变的交互重组子r47r104不能生长，所以无法检出，但是它的频率和相等，因此估算重组子数要将数乘以2，代入公式：,1955年Benzer：细菌噬菌体遗传区的精细结构 分离两个不同的（非互补的）r噬菌体突变子,因此可用以下公式计算相邻不同位点的遗传距离：,由于在E.coli B平板感染后得到的噬菌斑数为群体总数，在E.coli K12 ()的噬菌斑为基因内重组所得到的野生型的噬菌体数，所以以上公式可以表示为：,这一测定方法称为重组测验（recombination test ），它是以遗传图的方式确定突变子之间的空间关系（图8-5）。 根据公式 重组频率2（1103）/ 6.6109 3.3

15、106 0.0000033 （一百万分之3.3） 作图显示r+重组子最低频率，在r突变子中带有的异点等位突变是0.01%，最小的图距0.01%来对两个标记间的分子距离以碱基对表示的距离做一个粗略地估计。 可检测到两个r突变之间重组率为0.000 2%（211062106）。但实际上所观察的最小重组率为0.02% ，即0.02个图距单位，还没有发现小于这个数值的重组率（图8-6）,以前用来计算重组的方法是计算基因与基因之间的距离，而Benzer的方法可以用来测算一个基因内部不同位点的距离，它的精确度可达到十万分之一，也就是0.001个图距单位，故称作基因的精细作图。,例：噬菌体T41500 ma

16、p units (1.8105bp) 如果两个r突变子产生0.01% r +突变子，则意味突变是由0.02图单位所分开。 占整个T4 Genome: 0.02/1500 = 1.3105 T4 phage 有：1.8105bp 所观察到的最小重组距离： （1.3105）（1.8105）2.4 bp 这意味Benzers结果已显示遗传重组可能出现在2个碱基对顺序的距离内，后来由其他人的实验已做出结论性的说明，重组可出现在影响DNA中邻近碱基对的突变之间。 也就是说：遗传实验已经说明碱基对 既是 突变单位（unit of mutation） 也是 重组单位（unite of recombinati

17、on）,(3) 基因的基本概念 经典遗传学基因概念：基因是一个基本的结构单位，基因内不发生重组；基因是一个基本的突变单位，基因内部没有更小的突变发生；基因是一个基本的功能单位，它决定着一个特定的表型性状。 即：基因是一个重组、突变和功能三位一体的单位。,现代遗传学基因概念：Gene (Cistron) is the segment of DNA involved in producing a polypeptide Chain；it includes regions proceeding and following the coding region (leader and trailer)

18、as well as intervening sequences (introns) between individual coding segments(exons)。 基因内部可以发生重组，基因内部可以发生更小的突变 一些基因可被转录但不被翻译，如rRNA，tRNA等； 一些既被转录也被翻译，如Structural gene等。,例题：有两个T4噬菌体的r突变体同时感染E.coli后裂解，将其裂解液稀释成610-7感染E.coli B菌株后做成平板，产生18个噬菌斑，另一种稀释液浓度为210-5感染E.coli K菌株，做平板得14个噬菌斑，请你计算此两个基因之间的重组值。,为比较B、K上

19、的噬菌斑数目，由于稀释浓度不同，必须校正，所以在610-7稀释液中产生18个噬菌斑，则在210-5稀释液中产生的噬菌斑为： 18 210-5 610-7,= 18100/3 = 600,即相当于在210-5稀释液中可以产生600个噬菌斑。 因此，重组值 = 214/600 100% = 4.67%,8.3.2 T2突变型的两点测交与作图,检验噬菌体中基因重组的前提必须要有突变型，而不同突变型之间的基因重组首先是在噬菌体T2中发现的。,T2噬菌体突变型（ r ）是快速溶菌，产生大的、界限分明的噬菌斑，而野生型（ r ）是缓慢溶菌产生小噬菌斑； 宿主范围突变型（ h ）能感染大肠杆菌品系1和品系2

20、，产生透明的噬菌斑，而野生型（ h ）只能感染品系1，因为品系2的细胞表面能阻止T2噬菌体对它的吸附。 所以把T2噬菌体接种到大肠杆菌品系1和2的混合培养物上时，噬菌斑是半透明的。,将h r 与h r 同时感染大肠杆菌品系1，两种噬菌体都可以在品系1细菌细胞中进行增殖，同时也可能发生重组。,为了检验这两个基因位点之间是否发生重组，将其子代噬菌体再去侵染大肠杆菌品系1和品系2的混合培养物，结果出现4种而不是2种噬菌斑，既有亲本类型：大而半透明的h r 和,小而透明的 h r ；还有重组类型：小而半透明的 h r 和大而透明的h r,分别统计各种噬菌斑的数目，由此计算出重组值，去掉% ，作为图距进

21、行作图。,不同速溶性噬菌体的突变在表型上不同，可分别写成ra、rb、rc等，用hrxhrx获得的试验结果如下：,根据表8-5结果可以分别作出以下ra、rb 、rc与h之间的3个顺序：,由于有3个不同的r基因，故可根据表8-5的重组值列出以下4种可能的基因排列连锁图：,我们如何选出正确的排列？ 首先只考虑rb，rc和h rc-h-rb h-rc-rb 要进行rc rb+ rc+rb 的杂交，得到的重组值与rb-h间的距离进行比较，若rc-rb12.3=rb-h，则h位于中间，即排列顺序为rc-h-rb。 剩下的是ra在h的哪一边？ 这需做广泛的遗传学作用， 答案是ra-rc-h-rb和rc-h-

22、rb-ra都正确， 因为T2噬菌体的连锁图也是环状的。,？,8.3.3 噬菌体的基因重组与作图 Kaiser 1955年最早进行了噬菌体的重组作图试验。他用紫外线照射处理得到5个噬菌体的突变系： s 系产生小噬菌斑 mi系产生微小噬菌斑 c 系产生完全清亮的噬菌斑 co1系产生除中央一个环之外其余部分都清亮的噬菌斑 co2系产生比co1更浓密的中央环噬菌斑。 Kaiser用s co1 mi 杂交，所得后代有8种类型。病毒是单倍体，与二倍体生物不同，亲本组合与重组交换的组合可直接从后代中反映出来。8个类型中数目最少的两种类型就是双交换的结果，频率最高的两种是亲本类型，其余的为单交换类型。结果及分

23、析作图可归纳于表86。,从双交换的类型可知，这3个基因的次序就是sco1mi s与co1的图距应为3.83 cM；co1 与mi之间则为6.21 cM；因为有双交换的存在，s与mi之间的图距则为8.3220.8610.04 3个基因的遗传图:,8.3.4 T4 突变型的三点测交与作图 采用三点测交的方法，在噬菌体中同样可进行基因定位。用T4噬菌体的两个品系感染E. coli。一个品系:m r tu（小噬菌斑、快速溶菌浑浊溶菌斑）突变型。另一个品系对这3个性状都是野生型（）的。三点测交结果见表87：,根据上述结果，可绘出这3个基因的染色体图：,并发系数 = 0.033/（0.129 0.208）

24、= 1.2 并发系数大于1，为负干涉。 其主要原因在于： （1）与噬菌体DNA结构特点相关（裸露，不与组蛋白结合）； （2）与杂种DNA分子的基因转变相关。,三点测交所得8种噬菌斑都可观察到，单倍体的病毒、亲本型与重组型可直接从后代中表现出。 虽然将真核生物中两点测交和三点测交的基本原理和方法应用于噬菌体杂交，但是两者在杂交机制上是完全不同的： 噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传贡献取决于感染细菌时每种亲代噬菌体的相对数量。如基因型A与基因型B的亲代比10：1，则产生重组子代的数量A型常多于B型子代数。 噬菌体的基因重组发生在噬菌体的DNA复制以后，因此从单个混合感染的细菌中可以得到亲

25、代噬菌体和重组噬菌体；,噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换 在噬菌体中基因重组率可以随着宿主细胞裂解时间的延长而增加。 因此噬菌体杂交时，应该注意： 控制每种亲代噬菌体基因型的投放量。 控制允许发生复制和重组的时间。 只有控制这两个因素并在标准条件下进行杂交所, 得重组率才能用于绘制近似的遗传图,8.4 互补测验与顺反子 遗传学研究的基础必须有突变型，然后分析这些突变型之间的关系。重组测验与互补测验是确定这种关系性质的两个基本方法。已知重组测验是以遗传图距的方式确定基因的空间关系，而互补测验（ complementation test ）则是确定突变基因的功能关系。 为了界定基因的功能单位，

26、必须进行互补测验。1957年Benzer以大肠杆菌T4噬菌体为材料，通过互补实验，在DNA分子水平上，研究快速溶菌突变型r的基因精细结构。,如T4噬菌体的r 区中有3 000多个突变，它们都有相同的表型，这是由于所有的r 突变都导致丧失合成大肠杆菌K（）发育所需要的一种或几种蛋白质的能力，因此这些突变型对大肠杆菌K（）宿主细胞是致死的，但可以在大肠杆菌B菌株的细胞中增殖。既然它们有相同的表型，那么是否它们都影响同一遗传功能？ 即r 中这3 000多个突变是属于一个基因还是属于几个基因？ 为了界定基因的功能单位，必须进行互补测验，即用T4不同的r 突变型成对组合同时感染大肠杆菌K（）菌株。如果被

27、双重感染的细菌中产生两种亲代基因型的子代噬菌体，那么就必然是一个突变补偿了另一个突变所不具有的功能，这两个突变就称为彼此互补（ complementation） 。如果双重感染的细菌不产生子代噬菌体，那么这两种突变一定有一个相同功能受到损伤,所谓互补作用是指二个突变型染色体同处在一个细胞中，由于相对的野生型基因的互相补偿而使表型正常化的作用。 进行互补测验（complementation tests）必须是二个突变型染色体同处在一个细胞中（二倍体或部分二倍体合子），而且它们之间不发生重组或者只发生忽略不计的极少重组，否则将不能判断表型正常化是重组的结果还是互补的结果。,进行互补测验常用斑点测试

28、法（ spot test） 。用一种r 突变型以0.1的感染比（噬菌体1细菌10）去感染大肠杆菌K（）菌株。噬菌体和细菌在温热的琼脂中混合，涂布在营养平板上，琼脂凝固后，在平板上所划出的一定位置上再加一滴含有另一种r 突变型的培养基，在这一滴培养基的范围内，一些细菌就会被两种噬菌体所感染。如在这范围内形成噬菌斑，就证明这两种突变型互补，相反就不能互补。,互补测验的结果发现，除了一些缺失突变型外， r 突变型可分成r A 和r B两个互补群。所有r A突变型的突变位点都在r 区的一端，是一个独立的功能单位；所有r B突变型的突变位点都在r 区的另一头，也是一个独立的功能单位。凡是属于r A的突变

29、之间不能互补，同理属于r B的突变之间也不能互补，只r A的突变和r B的突变之间可以互补，即双重感染大肠杆菌K（）菌株后可产生子代。说明r A和r B是两个独立的功能单位，分别具有不同的功能，但它们的功能又是互补的，要在大肠杆菌K（）菌株中增殖，这两种功能缺一不可。由此可见， r 是由于这两种遗传功能丧失而形成的。,互补测验又称为顺反测验（ cis-trans test），所用的两个突变如果分别位于两条染色体上，这种组合方式称为反式排列，如果两个突变同时位于一条染色体上，则称为顺式排列。就是用这种反式构型检验突变之间的关系。如两个隐性突变表现出互补效应，则证明这两个突变分别属于不同基因；如不

30、能表现出互补，则证明这两个突变是在同一基因内。顺式排列只是作为对照，因为在顺式排列中，不论是两个基因的突变，还是同一个基因内两个位点的突变，在互补测验中均表现出互补效应。,顺式排列的效应不同于反式排列的效应的现象被称为顺反位置效应。Benzer通过该实验首先提出具有顺反效应的突变型，属于同一个顺反子。,结论：当两个突变型的顺式排列互补表现为野生型，反式排列不互补表型为突变型，这两个突变位点（sites）它们应属于同一基因（同一顺反子）。当两个突变型顺式、反式排列都表现为野生型，即没有顺反位置效应时，它们应属于不同的功能基因，位于不同的座位（非等位）上。,彼此不能互补的突变肯定影响相同的功能单位

31、； 彼此能够互补的突变必定影响不同的功能单位。,Benzer将这样一个不同突变之间没有互补的功能区称为顺反子（cistron），即遗传的功能单位就是一个顺反子。一个顺反子在染色体上的区域称为一个基因，而每个基因中有若干个突变位点，这是指一个顺反子内部能发生突变的最小单位。DNA中每一核苷酸对的改变都可能引起多肽链中氨基酸的改变，从而影响顺反子的功能。它们本身没有独立的功能，在它们之间可以重组。由此可见顺反子既具有功能上的完整性，又具有结构上的可分割性，这是人们对基因认识的新概念。,基因型 的个体，如果有互补作用，表示什么意思；没有互补作用又是什么意思？,+ a b +,在互补实验中，利用反式构

32、型检验突变之间的关系，两个隐性突变如果表现出互补效应，则证明这两个突变分属于不同的基因；如果不能出现互补，则证明这两个突变位点位于同一个基因内部。,如果不能互补，则说明a，b为同一2基因内的不同突变位点。,如果能互补，则说明a，b分属于不同基因。,假设a、b、c是隐性突变，而且是紧密连锁的位点，从实验得到下列结果：,野生型,野生型,野生型,突变型,问哪些突变型之间可以互补？哪些是等位基因？,在互补实验中，利用反式构型检验突变之间的关系，两个隐性突变如果表现出互补效应，则证明这两个突变分属于不同的基因；如果不能出现互补，则证明这两个突变位点位于同一个基因内部。,例题：大肠杆菌的8个突变体都不能在

33、没有组氨酸的培养基上生长。两两进行重组实验，发现所有的顺式杂合体都能在基本培养基上生长；而反式杂合体中，有的能在基本培养基上生长（+），有的则不能（0）。如图所示，是否能确定这8个突变位点分属于几个不同的顺反子？ 反式杂合体在基本培养基上的生长情况：,突变体 1 2 3 4 5 6 7 8 8 0 0 0 0 0 0 + 0 7 + + + + + + 0 6 0 0 0 0 0 0 5 0 0 0 0 0 4 0 0 0 0 3 0 0 0 2 0 0 1 0,两个隐性突变如果表现出互补效应，则证明这两个突变分属于不同的基因；如果不能出现互补，则证明这两个突变位点位于同一个基因内部。,据此分

34、析，7为独立基因，因为其可与1、2、3、4、5、6、8均可以互补，即7与1、2、3、4、5、6、8为不同基因。 1、2、3、4、5、6、8彼此不可以互补，所以其为同一基因内不同突变位点。,假设上题的8个突变体测试产生了下列结果，结论又该如何？,突变体 1 2 3 4 5 6 7 8 8 + + + + + + 0 0 7 + + + + + + 0 6 + + + + 0 0 5 + + + + 0 4 + + 0 0 3 + + 0 2 0 0 1 0,两个隐性突变如果表现出互补效应，则证明这两个突变分属于不同的基因；如果不能出现互补，则证明这两个突变位点位于同一个基因内部。,所以：7、8是

35、同一基因内的不同突变位点； 5、6是同一基因内的不同突变位点； 3、4是同一基因内的不同突变位点； 1、2是同一基因内的不同突变位点； 以上8个位点分属4个基因。,8.4.2 X174 条件致死突变的互补测验（P198199）自学8.4.3 T4 条件致死突变型的互补测验(p199)自学,8.4.4 基因内互补 一般情况下同一顺反子内两个突变是不能互补的，但是也有一些例外，这种例外发生于同一基因内两个不同位点突变致使两条原来相同的多肽转变成两条分别在不同位点上发生变异的多肽链，而后将这两条多肽构成双重杂合子，这两者配合起来，有可能表现出不同程度酶活性部位的恢复，这种现象称为基因内互补（intr

36、agenic/intracistronic complementation），又称等位（基因）互补（allelies complementation）。 这可能是由于有些突变所影响的多肽区域是作为亚基而相互起作用的，而有些突变所影响的多肽区域是作为活性表达所必需的，但不参与亚基的相互作用,编码多肽的基因多肽体蛋白 稀少情况下，出现基因内互补:突变的蛋白质的每个单体是没有活性的，但是，当这些单体结合在一起时，形成有活性的，功能上的多聚体。 在同一基因内两个不同位点的以反式排列所形成的杂合体中可以形成两种不同的肽链，一种在一个位置上有毛病，另一种在另一位置上有毛病。这样两种肽链聚合成的酶有时便可能

37、部分具有活性或完全具有活性。这表明，一个突变肽链的非突变片段的氨基酸顺序有可能补偿另一个不同的突变肽链的突变片段的氨基酸顺序。,基因内的互补与基因间的互补的主要区别： 任何两个不同基因间的突变总是互补的，即基因间互补是普遍存在的，而同一基因内不同位点突变绝大多数是不能互补的，只有少数例外； 基因内两个突变能互补的也只能是点突变，无缺失，这种突变的功能效应一定是错义突变，绝不是无义突变或移码突变； 基因内互补作用的酶活性往往明显低于正常水平，最多只有野生型酶活性的25% ，同时所形成的蛋白质也常有某种异常，例如温度的稳定性或pH依赖性等。,8.5 噬菌体T4 r 的缺失突变与作图,Benzer在

38、研究r 突变型时发现其中一些突变是由于碱基对发生了改变，这称为点突变（ point mutation）。而另一些突变是由于缺失了单个或相邻的许多碱基对，因此称为缺失突变（ deletion mutation）。尽管r 区这两种突变形成相同的表型效应，但它们是有区别的： 点突变是单个位点的突变，缺失突变通常是多个位点的突变，称为多位点突变（ multisite mutation） 。 点突变可以发生回复突变，而缺失突变则是不可逆的，因为不可能恢复原有数目和原有顺序的核苷酸对。 点突变与其他点突变之间可以发生重组，而缺失突变与另一个基因组内缺失区的点突变之间不可能重组，因为相应的片段已缺失，在这个

39、杂交中没有一个基因组在这个点突变的位置上有正确的核苷酸对，所以无法通过重组而恢复野生型碱基顺序。,8.5.1 缺失作图原理1-重组 缺失作图就是利用一系列缺失突变型，把所要测定的突变型和这一系列缺失突变型分别进行重组测定，凡是能和某一缺失突变型进行重组的，它的位置一定不在缺失范围内，凡是不能重组的，它的位置一定在缺失范围内。通过与一系列的缺失突变型进行重组的结果，可以精确确定某待测突变型（点突变）的位置。,如Benzer所选择的一组缺失突变就将r区划分成47个片段，只需做十几个杂交，而且只要记下大肠杆菌K()平板上是否出现重组体，就能将一个新的r突变位点定位在r区47个片段中。,8.5.2 缺

40、失作图方法,在0.5 mL大肠杆菌B菌本培养物中加入1滴缺失型噬菌体和1滴待测的r 突变噬菌体，几分钟后，取一滴菌液加在灭菌的纸条上，铺在长有大肠杆菌K（）菌本的平板上，经培养后如在纸条覆盖的区域内形成清晰的噬菌斑，则说明它们之间能发生重组，产生了野生型噬菌体，阴性结果就说明子代中重组体率低于10 5 ，空白对照里出现的几个噬菌斑是点突变的回复突变所产生的。,例：请根据下列实验结果划分出噬菌体T4的r缺失突变型a、b、c、d、e的缺失段。,解：根据：凡能和某一缺失突变型进行重组的，它的位置一定不在缺失的范围内；凡是不能重组的，它的位置一定在缺失范围内，这一原理。a与3无重组，説明缺失3包括了a

41、所在的位置；b与3和4都无重组，説明b在缺失3和4的范围内，同时表明，缺失3包括缺失4中b的位置。c与1无重组，説明其处于缺失1的范围，但同时又与2无重组，进而説明缺失2包括缺失1 的c位点，另有涉及d和e，而d所处的位置是缺失2和3都涉及到的，e位于缺失2中但绝未处在缺失1和3上。,例题：已知T4噬菌体r的突变体A、B、C，BC产生重组子，但AB与AC都不产生重组子。 （1）画出A、B、C缺失位置。 （2）假如又发现一个新突变体，它与B、C都能产生重组子，但不能与A形成重组子，你能确定它缺失的位置吗？,解答：（1） BC产生重组子，表明B、C互补，分属于不同的基因，且无重叠缺失部分， AB与

42、AC都不产生重组子，表明彼此不互补，且A与B，A与C均有共同缺失区段，有如下关系：,C,B,A,或,C,B,A,（2）由于新突变体与B、C都可以产生重组子，所以该突变与B、C无共同缺失区段；但由于不能与A形成重组子，所以应该位于A缺失区段内。如图所以，椭圆形阴影区域表示新突变体缺失区段。,C,B,A,C,B,A,或,8.6 噬菌体的基因组与位点专一性重组 8.6.1 噬菌体的基因组 8.6.2 原噬菌体与合子诱导 8.6.3 原噬菌体的整合与切除 8.6.4 位点专一性重组的分子机制,8.6.4 位点专一性重组的分子机制 在能识别特定的核苷酸序列的重组酶作用下，DNA分子间的重组。 位点专一性

43、重组（ site-specific recombination）涉及两个特异位点的反应，靶位点短小，长度通常在14 50 bp。某些情况下，两个位点含有相同序列；在另一些情况下，它们则是不同源的。催化位点专一性重组的酶称为重组酶（ recombinase） 噬菌体DNA的整合和切离是典型的位点专一性重组。,（1） 噬菌体的整合与切离 DNA 存在两种物理状态： 裂解周期：DNA环状分子独立存在于细菌的细胞质中 溶源周期：溶源化状态的DNA整合在细菌的染色体中 在溶源状态时， 噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分，称为原噬菌体。,相互转变：,裂解状态 溶源状态,这两种类型之间的转换是通过位点专一性

44、重组实现的.,细菌染色体上的特异位点称为attB，由BOB序列构成，噬菌体DNA上附着位点称为attP，由PO P序列构成。attB和attP都有核心序列O（ core sequence），为15 bp的同源序列,富含AT对，无碱基回文对称。而重组事件就发生在这个核心序列内。两侧区域B，B和P，P被看成是两臂，它们在序列上相距很远。,整合与切离是通过细菌和噬菌体DNA上特定位点的重组而发生，这些位点称为附着位点（attachment sites，att） 。,因为噬菌体DNA 是环状的，所以必须以线性序列的形式插入到细菌染色体中去。原噬菌体位于两个新的att位点之间，原噬菌体左边的位点attL由序列BO