2011硕士研究生LC-MS讲座.ppt

1、高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)技术原理与应用,河北医科大学药学院 王巧,什么是MS仪: Mass Spectrometry,一种能够把分子转化生成带电离子,并在气态中根据质荷比(m/z : m质量 z电荷数 )的不同把离子进行分离并进行检测的仪器.,质谱分析过程：样品通过进样系统进入离子源，由于结构性质不同而电离为各种不同质荷比（m/z）的分子离子和碎片离子，而后，带有样品信息的离子碎片被加速进入质量分析器，不同的离子在质量分析器中被分离并按质荷比大小依次抵达检测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质量谱，也就是质谱 (mass spectrum)。 质谱：按离子的质荷比的大小依次

2、排列形成的图谱,质谱技术：,M1 M2,(M1+1)+ (M2+1)+,离子源,准分子离子 (M+1)+ 多电荷离子 (M+nH)n+,质量分析器,质谱分析系统的基本组成,真空系统,1电子轰击电离(EI) GC/MS 2化学电离(CI) GC/MS 3 大气压化学电离(APCI) LC/MS 4电喷雾电离(ESI) LC/MS 5基质辅助激光解吸电离(MALDI) 6场致电离 - Field ionization 7火花放电 - Spark source 8激光电离 - Laser ionization (LIMS) 9共振电离Resonance ionization(RIMS) 10热电离

3、- Thermal ionization (TIMS) 11快原子/离子轰击(FAB/SIMS )离子源 等离子体解吸(PD),质量分析器,Turbo VTM 离子源,电喷雾(ESI)离子源工作原理,电喷雾离子化分为三个过程: (液态带电） 1 形成带电小液滴 2 溶剂蒸发和小液滴碎裂 3 最终形成气相离子,离子源的选择-ESI,优点 适合范围广:分析离子型/极性化合物、难挥发或热不稳定性化合物 多电荷离子的形成，可以分析高分子量化合物 灵敏度高,缺点 在溶液中必须形成离子 流动相中缓冲盐的种类和浓度对灵敏度均有显著影响，因此流动相的选择非常重要 具有流速依赖性 基质抑制现象较为明显,APCI

4、 三步离子化的过程(气态带电） 溶剂快速蒸发形成气态分子 电晕针放电使离子源内溶剂带电 带电的溶剂离子与组分气态分子发生电荷转移，生成分子离子,大气压化学电离源 (APCI) 又叫:加热雾化源 Heated Nebulizer,离子源的选择- APCI,优点 有一定挥发性的中等极性或低极性的小分子化合物 对溶剂选择、流速和添加物的依赖性较小,缺点 有可能发生热裂解 样品需要有一定的挥发性 适合分析分子量小于2000 Da 的样品,离子源,1 扇形磁场和静电场质量分析器 2 傅里叶变换离子回旋共振 3 飞行时间分析器 4 四极杆分析器 (定量) 5 离子阱分析器 （定性）,串联质谱,B,应用,制

5、药：合成过程中中间体、成品的结构鉴定，杂质分析 天然药物与中药分析：结构鉴定，质谱规律，中药药效物质基础 药物代谢药物动力学：药动学 药物代谢物寻找 代谢组学(metabonomics) 蛋白组学（生物大分子分析） 烟草 食品分析 公安毒物检查 体育兴奋剂检测 中药中非法添加化学药 新生儿筛查,制药行业,合成过程中中间体、成品的结构初步鉴定 杂质分析,液质联用分析美伐他汀的有关物质,制备液相分离，核磁确证结构,天然产物与中药分析,10个香豆素对照品,Xanthotoxin,Zorbax SB-C18色谱柱保护柱 流动相：(A)乙腈-(B)0.3%醋酸水溶液 0-20 min ：A 25%-30

6、%，B 75%-70% 20-37 min：A 30-50，B 70-50 37-45 min：A 80%，B 20% 流速：1.0 mlmin-1 检测波长：275 nm 全波长扫描范围：190-400 nm 柱温：40,液相色谱条件,质谱条件,ESI源 负离子检测 扫描范围：80-1000 m/z 鞘气流：50 arb 辅助气流：15 arb 源电压：5.00 kV 毛细管温度：350 毛细管电压：-12.00 V 管透镜补偿电压：-10.00 V,HPLC-MS技术定性分析生物样品、降香药材中黄酮类成分,22,authentic compounds (HPLC-UV),authentic

7、 compounds (TIC-MS),对照品的HPLC-MS色谱图,22,the total flavonoids of D. odorifera (HPLC-UV),the total flavonoids of D. odorifera (TIC-MS),降香总黄酮的HPLC-MS色谱图,serum sample with enzyme hydrolysis,serum sample without hydrolysis,blank serum,大鼠口服降香总黄酮后血清样品的TIC-MS色谱图,18,18,血清 TIC-MS,大鼠口服降香总黄酮后尿样的TIC-MS色谱图,blank ur

8、ine,urine sample without hydrolysis,urine sample with enzyme hydrolysis,18,18,尿样 TIC-MS,大鼠口服降香总黄酮后肝脏样品的TIC-MS色谱图,blank liver,liver sample without hydrolysis,liver sample with enzyme hydrolysis,16,16,肝脏 TIC-MS,blank kidney,kidney sample without hydrolysis,kidney sample with enzyme hydrolysis,大鼠口服降香总黄

9、酮后肾脏样品的TIC-MS色谱图,17,18,肾脏 TIC-MS,blank lung,lung sample without hydrolysis,lung sample with enzyme hydrolysis,大鼠口服降香总黄酮后肺脏样品的TIC-MS色谱图,7,7,肺脏 TIC-MS,大鼠口服降香总黄酮后心脏样品的TIC-MS色谱图,blank heart,heart sample without hydrolysis,heart sample with enzyme hydrolysis,10,10,心脏 TIC-MS,大鼠口服降香总黄酮后脾脏样品的TIC-MS色谱图,blank

10、 spleen,spleen sample without hydrolysis,spleen sample with enzyme hydrolysis,7,12,脾脏 TIC-MS,中药制剂中掺入西药成分分析,液质联用分析中药降糖制剂中掺入的西药成分,药物代谢与药物动力学,空白血浆样品色谱图,空白血浆添加内酯苷和芍药苷的色谱图,大鼠灌服白芍总苷溶液后血浆样品色谱图,内酯苷,栀子苷,芍药苷,5.83,6.55,4.53,芍药苷和芍药内酯苷同时测定多离子反应监测色谱图,白芍总苷药动学研究,公安、司法鉴定,LC-MS/MS技术在法庭科学中的应用,毒品/滥用药物：可卡因、海洛因、吗啡、摇头丸、迷幻

11、药等等 2001年1-6月缴获海洛因6201千克、鸦片1927千克、冰毒2970千克、摇头丸64万粒、度冷丁1400支、咖啡因80千克、罂粟壳40吨、易制毒化学品72吨 毒物：鼠药、农药、工业毒物、药物毒物、蛇蝎蜂毒、河豚毒素及其它海洋生物毒素、植物毒素等等 爆炸物：硝化甘油、OCTOGEN、HMX、EGDN、HEXOGEN、RDX、NG、TETRYL、DNT和PETN等等 其它化合物：案发现场遗物如油漆、血迹、高聚物等,质谱在生物大分子研究领域中的应用,1 蛋白质和多肽的分析 2 寡核苷酸和核酸的分析 3 微生物鉴定 4 药物设计 5多糖结构测定,蛋白质和多肽的分析,分子量测定 肽谱测定 肽

12、及蛋白质序列测定 巯基和二硫键定位 蛋白质翻译后修饰分析 抗原决定部位指认 生物分子相互作用及非共价复合物分析,液质联用蛋白质组学鉴定方法的建立 其在正常人尿蛋白质组鉴定中的应用 （中国协和医科大学博士论文） 液质联用分析重组人白细胞介素2的肽图 （药学学报2006, 41 (8) : 756 760）,新生儿筛查,新生儿筛查是对一些目前还无法在产前做出诊断的先天性代谢性疾病及内分泌疾病在新生儿进行普查，以筛选出病人，提前做出诊断，提前进行治疗,Why?,这些先天性疾病疾病目前在出生以前用产前检查的方法还无法诊断，婴儿出生以前又没有有病的迹象 一旦出现异常情况以后，身体和智力已经受到不可逆转的损害，失去治疗的机会 为了对这些疾病做出早期诊断，从60年代起。欧美一些国家和日本等国开展了新生儿筛查工作，多年以来，这是一种行之有效的措施。通常的化验方法是采血和采尿,现在新生儿筛查主要是针对：,先天性甲状腺功能低下（服用甲状腺激素可以完全避免痴呆的发生） 苯丙酮尿症（只要不服用含有苯丙氨酸的包括人奶在内的食品就可以完全避免痴呆的发生） 半乳糖血症（只要不服用含有乳糖的包括人奶在内的食品就可以完全避免痴呆的发生）,新生儿筛查的一