课题3　血红蛋白的提取和分离

1、,专题五DNA和蛋白质技术,课题三血红蛋白的提取和分离,1说出提取生物大分子的基本过程和方法； 2知道色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。,一、蛋白质的分离原理 1依据：蛋白质特性的差异 (1)分子_。 (2)溶解度。 (3)吸附性质。 (4)所带_的性质和多少。 (5)对其他分子的亲和力。,形状和大小,电荷,2凝胶色谱法 (1)概念：凝胶色谱法也称做_，是根据被分离蛋白质的_，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有效方法。,分配色谱法,相对分子质量的大小,(2)原理：大多数凝胶是由_构成的小球体，内部有许多贯穿的通道，当不同的蛋白质通过凝胶时，_的蛋白质容易进入凝胶内部的

2、通道，路程_，移动速度_；而_的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在_移动，路程_，移动速度_。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 (3)凝胶材料：_性，_类化合物，如_或_。,多糖类化合物,相对分子质量小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,多孔,多糖,葡聚糖,琼脂糖,3缓冲溶液 (1)作用：在_内，能够抵制_对溶液_的影响，维持_基本不变。 (2)配制：通常由_溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_就可以制得在_使用的缓冲液。,一定范围,外界的酸和碱,pH,pH,12种缓冲剂,使用比例,不同pH范围内,4电泳 (1)概念：带电粒子在_的作用下发生_的过程。 (2)原理：许多

3、重要的生物大分子，如_、_等都具有_的基团，在一定pH下，这些基团会带上_或_。在电场的作用下，这些带电分子会向着_移动。电泳利用了分离样品中各种分子_以及分子本身的_、_不同，使带电分子产生不同的_，从而实现样品中各种分子的分离。,电场,迁移,多肽,核酸,可解离,正电,负电,与所带电荷相反的电极,带电性质不同,大小,形状,迁移速度,(3)分类：_凝胶电泳、_凝胶电泳。 在测定蛋白质相对分子质量时通常使用_ _凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它_以及_等因素。而在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中，SDS能使蛋白质发生_，由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会_成单条肽链，因此

4、测定的结果只是_的相对分子质量。同时SDS所带的大量负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于_。,琼脂糖,聚丙稀酰胺,SDS聚丙烯,酰胺,所带净电荷的多少,分子的大小,完全变性,解聚,单条肽链,分子的大小,二、实验操作 1样品处理 (1)红细胞的洗涤 采集血样_离心用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤低速短时间离心_三次。,低速短时间,重复洗涤,蒸馏水,10 min,(3)分离血红蛋白溶液 将血红蛋白溶液离心将试管中的液体用_过滤除去脂溶性沉淀层于分液漏斗中静置片刻分出下层的_。 2粗分离：即透析，取1 mL

5、的血红蛋白溶液装入_中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的_中(pH为7.0)。,滤纸,红色透明液体,透析袋,磷酸缓冲液,3纯化：即样品的加入和洗脱 (1)调整缓冲液面：与_平齐。 (2)滴加透析后的样品：用量为1 mL，不要破坏_。 (3)打开_，使样品渗入凝胶床，样品完全进入凝胶层后关闭下端的出口。 (4)洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱，不能发生_现象。 (5)收集：待_接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，连续收集。,凝胶面,凝胶面,下端的出口,洗脱液流干,红色蛋白质,4纯度鉴定：在鉴定的方法中，使用最多的是_电泳。,SDS聚丙烯酰胺凝胶,1怎样判断是否

6、完成了血液样品的处理？ 提示：观察你处理的血液样品离心后是否分层。如果分层不明显，可能是洗涤次数少，未能去除血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、操作提示 1红细胞的洗涤：_、_与_十分重要。_过少，无法除去血浆蛋白；_过高和_过长会使_等一同沉淀，达不到分离的效果。 2色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在_中膨胀，可以将加入其中的_用_加热，加速膨胀。,洗涤次数,离心速度,离心时间,洗涤次数,离心速度,时间,白细胞,洗脱液,湿凝胶,沸水浴,3凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡

7、会搅乱洗脱液中蛋白质的_，降低_。 4蛋白质的分离：如果红色区带_地移动，说明色谱柱制作成功。,洗脱次序,分离效果,均匀一致,2随着人类跨入基因组和蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，人们首先要做到的第一步是什么？ 提示：获得高纯度的蛋白质。,一、实验操作分析 1样品处理、分离与纯化的目的不同,2.分离血红蛋白溶液的结果 溶 液 分 为 4 层,3凝胶色谱操作 (1)凝胶色谱柱的制作 取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端磨平； 柱底部制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目的尼龙纱将橡皮塞上部包好； 柱顶部制作：打孔安装玻璃管； 将上述三部分按相应位置组装

8、成一个整体。,(2)凝胶色谱柱装填(过程) 计算：根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。 凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配制成凝胶悬浮液。 固定：将色谱柱垂直固定在支架上。 装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。 洗涤平衡：用20 mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密。,4注意事项 凝胶色谱柱的装填时，不能有气泡存在，不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒现象，否则需要重新装填。 如果凝胶长期不用，可以加入抑菌剂，低温保存，使用时再进行充分平衡。,解析：本实验中使用的交联葡聚糖凝胶(G75)，其中G表示凝胶的交联程度、膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，

9、即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g；气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果，因此，一旦发现有气泡，必须重装；在洗脱过程中，应在约50 cm高的操作压下，用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12小时，以使凝胶装填紧密；凝胶溶胀时，应使用蒸馏水将其充分溶胀，制成凝胶悬浮液。 答案：D,二、课题成果分析与评价 1血液样品的处理 分层明显样品处理完成 分层不明显原因：洗涤次数少，未能除去血浆蛋白；离心速度过快和时间过长,2凝胶色谱柱的装填 放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查是否装填得均匀 加入大分子有色物质，色带均匀、狭窄、平整装填成功,3血红蛋白的分离 血

10、红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，洗脱液缓慢流出分离成功 血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽分离效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关,2关于样品的加入和洗脱的叙述正确的是() A先加入1 mL透析后的样品 B加样前要使缓冲液缓慢下降全部流出 C如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功 D洗脱时可以用缓冲液也可以用清水 答案：C,血红蛋白的提取与分离,如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列问题：,(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用体现了蛋白质具有_功能。 (2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是_；乙装置中，C溶液的作用是_。 (3)甲

11、装置用于_，目的是_。 用乙装置分离蛋白质的方法叫_，是根据_分离蛋白质的有效方法。 (4)用乙装置分离血红蛋白时，待_时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。,解析：用透析法(如图甲)对血红蛋白进行粗分离，将血红蛋白溶液装入透析袋中，可以除去样品中分子较小的杂质。血红蛋白的纯化采用凝胶色谱法(如图乙)，血红蛋白相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路径较短，移动速度较快，可以收集到红色的蛋白质。 答案：(1)运输(2)磷酸缓冲溶液洗脱血红蛋白(3)透析(粗分离)去除样品中相对分子质量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小(4)红色的蛋白质接近色谱柱的底端,

12、电泳技术的原理与操作,A电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动 C蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少 D用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小,解析：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 答案：C,旁栏思考 你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？ 提示：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分