第一章 染色体与DNA.ppt

1、第一章 染色体与DNA,第一节 染色体,染色体原来是指真核细胞染色后，存在于核内的着色物体。它只存在于分裂中的真核细胞内。在非分裂细胞内，它是无定形的，并弥散于核内，只是在有丝分裂前才形成确定的形状。 现在，染色体已被普遍用于指存在于病毒、细菌、真核细胞及其细胞器内所含的核酸分子。,一、真核细胞染色体的组成,组蛋白：H1、H2A、H2B、H3、H4； 非组蛋白：HMG蛋白、DNA结合蛋白 DNA：不重复序列；中度重复序列；高度重复序列 少量的RNA；,二、染色体的一般形态结构,细胞分裂中期染色体的结构特征： 1、着丝粒：纺锤丝的附着部位； 2、端粒：能封闭正常染色体末端并维持染色体的稳定性；

2、3、染色单体：复制时产生的染色体拷贝；,三、染色体的超微结构,核小体是染色体包装的基本单位；,核小体的结构,每一个核小体核心包含有146bp DNA和8个组蛋白分子（2H2A，2H2B，2H3，2H4）；H1,核小体结构模型,核小体结构模型,染色体的串珠状形式与螺线管结构,DNA在每个组蛋白核心外缠绕约2圈 146bpDNA的核小体核心由54bp间隔DNA连成一条串珠状结构； 核小体螺旋形缠绕形成螺线管结构，每一周螺旋含6个核小体，因此，DNA长度缩短了6倍。,从DNA到染色体的包装压缩,DNA链 核小体 螺线管 染色单体 超螺旋 压缩比例：7*6*40*5 = 8400,（1：7）,（1：6

3、）,（1：40）,（1：5）,四、原核生物基因组的特点,1、基因组小，DNA含量低 2、一般不具有核小体结构 3、重复序列少，结构简炼，基因组内绝大部 分序列用于编码蛋白质 4、存在转录单元 5、有重叠基因（基因B在基因A内；两个基因部分重叠；两个基因只有一个碱基对重叠）,X174 的遗传,X174 的遗传,第二节 DNA 的结构,DNA 的一级结构； DNA的二级结构； 变性与复性 DNA的高级结构；,一、DNA 的一级结构,概念： DNA的一级结构是指4种脱氧核苷酸的连接及其排列顺序，表示了DNA分子的化学组成。 组成：脱氧核苷酸：dAMP、dTMP、dCMP、dGMP 碱基互补配对原则：

4、AT，GC,DNA序列的组成（单链）,核苷酸的组成,磷酸(phosphate)； 戊糖(pentose)； 碱基(base)：A、T、G、C,戊糖,左：核糖，存在于RNA中 右：脱氧核糖，存在于DNA中,碱 基,磷酸二酯键的形成与核苷酸链,核苷酸链间碱基配对,二、DNA 的二级结构,概念： DNA的二级结构是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所生成的双螺旋结构。 类型： 右手螺旋：A-DNA，B-DNA 左手螺旋：Z-DNA,B-DNA的模型,B-DNA和Z-DNA的比较,B-DNA的特点,1、主链：右手双螺旋结构 2、碱基配对：A T，G C 3、螺旋参数：0.34nm，3.4nm，10bp，4、

5、大沟和小沟：大沟中碱基的差异很易被识别，是蛋白质结合特异DNA序列的位点。,Z-DNA的特点,1、Z-DNA是左手螺旋，每个螺旋含 12 个碱基对，比A-DNA拧得更紧； 2、双螺旋中不存在深沟(大沟)，只有浅沟(小沟)； 3、双螺旋的轴心在碱基对之外； 4、Z-DNA中磷酸二酯键的连接呈锯齿形，这是Z-DNA（zigzag DNA）名称的由来。 5、Z-DNA中鸟嘌呤碱基的第八位C原子位于双链之外。由于Z-DNA上几乎不存在易被蛋白质识别的大沟，Z-DNA可能是靠鸟嘌呤碱基与化学物质发生识别反应。,三、DNA的变性和复性,（一）、双螺旋的变性； （二）、复性与杂交；,（一）、双螺旋的变性,1

6、、变性（denaturation）：也叫熔解（melting），是指DNA双螺旋的两条链完全分开成为单链的现象。 2、变性后DNA理化性质会发生变化： 3、DNA的熔点或熔解温度（Tm）：双螺旋结构失去一半时的温度。 4、影响DNA Tm值大小的因素：见下页,影响DNA Tm值大小的因素,1、DNA的均一性：均一性越高的样品，熔解过程越是发生在一个很小的温度范围内。 2、G-C的含量：G-C含量越高，Tm值越高，成正比关系。测定Tm值可计算G-C含量：（G-C）%=（Tm-69.3） 2.44 3、介质中的离子强度：一般说，离子强度较低的介质中，Tm较低，范围也较窄。而在较高的离子强度的介质中

7、，情况则相反。所以，DNA制品应保存在较高浓度的缓冲液或溶液中。,（二）复性与杂交,1、复性（renaturation）：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又重新结合成为双螺旋结构的过程。 2、复性的过程：1）DNA单链随机碰撞，互补序列碱基配对形成一个短的双螺旋区域；2）区域延伸至整个分子，形成一个长的双螺旋分子。 3、杂交：见下 4、影响复性速度的因素：见下,杂 交,不同来源的两个互补核酸序列相互退火形成双螺旋结构的反应。核酸杂交分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交。根据介质不同，又可分为滤膜杂交和溶液杂交。杂交能力可反映它们之间的互补程度。,核酸是通过碱基配对来进行杂交的,影

8、响复性速度的因素,1、DNA分子的复杂程度； 2、溶液中DNA的浓度； 3、DNA片段的大小； 4、复性温度； 5、溶液的离子强度。,四、DNA的高级结构 超螺旋结构,超螺旋：环状DNA或线状DNA的局部区域，双螺旋的轴在内部张力的胁迫下高度弯曲形成的结构。 超螺旋DNA比伸展DNA更为密实，所以其Tm值、浮力密度和电泳迁移率都增大。 超螺旋的形成：见下页,松弛型DNA与超螺旋型DNA的结构比较,DNA的超螺旋结构图,超螺旋的形成,L=T+W（L-连接数，T-双螺旋盘绕数，W-超螺旋数）。 当环DNA处于自然伸展状态时，以B-DNA的形式存在，内部张力为0，W=0，L=T=碱基对总数/10。

9、如果T=碱基对总数/大于10的数，则存在内部张力，双链必须进一步盘绕使W大于0为正值，此时环DNA以正超螺旋存在，L=T+W。 如果T=碱基对总数/小于10的数，则内部存在负张力，双链必须进一步盘绕使W小于0，此时，DNA以负超螺旋存在， L=T+W 。,DNA分子形成超螺旋的生物学意义,1.具有更紧密的形状,在DNA组装中具有重要的作用. 2.超螺旋程度介导了DNA结构的动态性变化. 3.超螺旋的引入提高了DNA的能量水平. 4.负超螺旋的存在会影响DNA结构变化的平衡,超螺旋DNA能实现松弛型DNA所不能实现的结构转化.,第三节 DNA的复制,一、DNA的半保留复制机理 二、复制的起点、方

10、向和速度 三、复制的几种主要方式 四、DNA复制所需要的酶与蛋白质 五、DNA复制的半不连续性 六、DNA复制的过程 七、DNA复制的调控,一、DNA的半保留复制机理,半保留复制机理： 实验验证：,半保留复制机理,首先，碱基间的氢键断裂使DNA分子双链解旋，分开；然后，每条单链作为模板合成其互补链，各自形成一个新的双链DNA分子。,半保留复制的实验验证,1、E.coli长期在15N上培养，得到15N-DNA； 2、转移到14N培养基上，一代后得到15N- 14N杂合的 DNA分子；离心时DNA带位于14NDNA和15NDNA二者之间； 3、继续培养，子二代离心为两条等量的带，分别为15N- 1

11、4N DNA 带和14N-DNA带； 4、继续培养， 14N-DNA带增多。,二、复制的起点、方向和速度1,复制起点（ori）：DNA分子上开始复制的特定位置。 复制叉：DNA分子中正在进行复制的分叉部位。它由两条亲代链及在其上新合成的子链构成。 复制子：生物体DNA上的一个复制单位叫复制子。 复制眼：DNA正在复制的部分在电镜下看起来象一只眼睛，称为复制眼。 原核生物DNA上只有一个复制起点，一个复制叉，为一个复制子。细菌DNA每复制一次需相当于细胞生长一代的时间;噬菌体和病毒在一个感染周期中， DNA可起始多次复制。 真核生物DNA上具有多个复制起点，可从多处同时开始复制，形成多个复制叉，

12、即包含有多个复制子。,2、复制方向和速度,大多数生物体内DNA的复制都是从复制起点开始以双向等速形式进行。 少数为双向不等速或单向方式进行复制。,R1,R2,R3,复制叉的单向移动,三、复制的几种方式,1、线状DNA双链的复制； 2、环状DNA双链的复制： 1）型复制（双向进行）； 2）滚环型复制（单向进行）； 3）D-环型（单向进行） ；,线状DNA双链的复制,线状双链DNA上复制叉生长方式有单一起始点或多个起始点，在此形成复制眼，从复制眼开始复制叉可以单向(如腺病毒)及双向(如T7噬菌体)移动。真核生物都为多复制眼起始的双向复制。,腺病毒DNA的复制,DNA的复制在分子的两端独立起始，并按

13、链置换的方式起始。 置换出的链由两端的反向重复序列配对形成双链区，起始复制。,型复制,为环状DNA分子的半保留复制方式； 复制从ori开始以顺时针和逆时针双向进行时，复制的中间产物在电镜下表现为型。,滚环型复制,为单向复制，如噬菌体X174 的单链DNA分子的复制。 复制过程：见书P42,D-环（取代环复制）,单向复制：双链环在固定点进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代，在电镜下呈D环形状。待一条链复制到一定程度，露出另一条链的复制起点，另一条链才开始复制。这表明：两条链的复制起点并不总在同一点上，当两条链的起点分开一定距离时就产生D-环复制。,四、DNA

14、复制所需要的酶与蛋白质（功能）,1、原核DNA聚合酶（polymerase）； 2、真核DNA聚合酶； 3、DNA连接酶（ligase）； 4、解链酶（helicase）； 5、DNA拓扑异构酶； 6、单链结合蛋白（single-strand bindingprotein，SSB蛋白）,原核DNA聚合酶（E.coli),缺口平移（nick translation）技术,真核DNA聚合酶,DNA聚合酶：DNA引物合成 DNA聚合酶：DNA损伤修复 DNA聚合酶：线粒体DNA复制 DNA聚合酶：主要DNA复制酶 DNA聚合酶：补平去掉RNA引物后的缺口,DNA连接酶（ligase）,催化双链DNA

15、切口处相邻碱基的5-磷酸基与3-OH生成磷酸二酯键。 DNA连接酶在DNA的复制、修复和重组中发挥重要作用。,解链酶（解旋酶、helicase）,解链酶利用ATP水解的能量使DNA双股链分离，并在DNA上沿一定的方向移动。 生物机体含有多种解螺旋酶，有些解螺旋酶参与DNA复制，有些解螺旋酶参与DNA修复、重组等非复制过程。,DNA拓扑异构酶（旋转酶）,作用：解除环状DNA分子复制时在复制叉前面的正超螺旋，使超螺旋分子松弛，保证复制的快速进行。,单链结合蛋白（SSB）,作用：保证解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构。,五、DNA复制的半不连续性,DNA复制过程中，由于DNA聚合酶只能催化5

16、 3方向的合成，前导链进行连续复制而滞后链进行先合成冈崎片段再连接起来的不连续复制，称为DNA的半不连续复制。,六、复制过程（了解）,1、复制的引发；前导链是由RNA聚合酶以DNA为模板合成一段RNA引物来引发DNA聚合酶合成的;滞后链依靠引发体的形成来引发。引发体由6种蛋白构成的引发前体与引发酶构成，在另一条模板链上前进，断断续续合成RNA引物。 2、链的延长；DNA聚合酶沿53方向合成前导链和滞后链的冈崎片段， 聚合酶切下RNA引物的同时补平gap,并在DNA连接酶的作用下将冈崎片段连接起来。 3、复制的终止；不需特定信号和特殊蛋白的参与。,DNA复制的忠实性,取决于碱基配对的专一性： 1

17、、DNA聚合酶的碱基选择作用：DNA聚合酶能够依照模板的核苷酸，选择正确的dNTP参入到引物末端。 2、35 外切酶活性的校对控制：当发现错配时，DNA聚合酶可切除新加入的碱基。,七、DNA复制的调控（了解）,1、E.coli染色体DNA的复制调控：起始于OriC的复制,起始频率取决于DnaA蛋白的浓度；起始于OriH的复制不依赖于DnaA，而被RNaseH抑制。 2、ColE1质粒DNA的复制调控：受RNA1（反义RNA）和Rop蛋白的负调控。 3、真核细胞DNA复制的三个调控点：,细胞生活周期水平调控。 染色体水平调控。 复制子水平调控。,八、DNA的修复,1、错配修复 2、切除修复（碱基

18、切除修复、核苷酸切除修复） 3、 DNA的直接修复,错配修复,错配修复是以模板链的信息来纠正新合成链错配碱基的一种修复方式，主要修复DNA复制后的错配碱基 。 错配修复系统能区分新链及模板链。区分方式是用Dam甲基化酶在模板链上GATC序列中的A（N-6）位置上进行甲基化修饰。 当两链发生错配时，新链的碱基会被纠正。,错配修复,MutS（mutatorS）蛋白(错配修复蛋白)是大肠杆菌DNA错配修复系统的错配碱基识别成分,它能够单独识别并与之结合。 MutS蛋白在结构与功能上具有高度保的守性。MutS蛋白对错配碱基具有特异识别、结合功能 。,错配修复,单链核酸的核酸外切酶包括大肠杆菌核酸外切酶

19、(exo)和核酸外切酶(exo)。 核酸外切酶(exo)能够将呈单链状态的DNA分子从5-末端或3-末端降解,产生出寡核苷酸短片段,而且是唯一不需要Mg2+的活性酶 。,大肠杆菌碱基错配修复机制:,MutS蛋白与错配碱基结合，MutH与GATC结合，MutL使MutS和MutH连结成复合体，MutH的位点专一核酸内切酶活力在未甲基化链GATC序列中G的5侧切割。 核酸外切酶在Helicase及SSB协助下将未甲基化链从 GATC位点至错配位点整段切除。 若被切割的GATC位点在错配位点的3端，由exo以35方向将核酸链降解。 若被切割的GATC位点在错配位点的5端，则由exo（53或35降解单链）或RecJ（53降解单链）以53方向降解核酸链。 DNA pol及ligase根据模板链的序列填补新链被切除部分，包括错配的碱基。GATC位点与错配位点的距离可能长达1000nt以上。因此，为了修复一个错配碱基，有时需重新合成一千个以上的碱基。,切除修复,切除修复对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点、嘧啶二聚体、碱基烷基化、单链断裂等都能起修复作用。,切除修复,切除修复过程：由核酸酶识别DNA的损伤位点，在损伤部位的5侧切开磷酸二酯键。由53核酸内切酶将有损伤的DNA片段切除。在DNA聚合酶的催化下，以完