第五章目的基因的获取.ppt

1、第五章目标基因的获得：制备待分离、修饰、扩增或表达的基因。1.限制性内切酶法，使用限制性内切酶将基因组DNA切割成不同大小的片段。，由于产品的粘性末端，产品可以直接链接到载体。1。优势。缺点，目标基因也可能有这种核酸内切酶的切点。目标基因也被切成碎片！Bamh I，Bamh I，Gene，1。限制性内切酶局部消化法，控制内切酶的量和消化时间，使基因组中只有一部分内切酶位点被随机切割。核酸内切酶识别位点的碱基数量影响切割产物的长度和随机性。(1)限制性内切酶的选择原则，和(1)一个4 BP的内切酶，平均切割点为每46(40961)4bp。2)6bp核酸内切酶，平均切割点为每44(256)bp。具

2、有高度的随机性。例如Hae、AluI、Sau3A。核酸内切酶的粘性末端，可以与普通的克隆位点相连。(1)超声波对脱氧核糖核酸有很强的作用，可以将它分解成大约300个碱基的随机片段。(2)当以1500转/分的速度高速搅拌30分钟时，可以产生约8kb的随机碎片。1976年，科兰纳提出了用化学方法合成基因的想法，并于1979年发表了一篇关于大肠杆菌酪氨酸tRNA基因首次成功合成的论文。在第二部分，目标基因的化学合成，1。目前常用的方法包括磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动合成法。保护dNTP的5-末端磷或3-末端羟基，用酸或碱去保护，原则，1。磷酸二酯法，单核苷酸连接有保护，保证

3、合成反应的定向进行。具有5个保护的单核苷酸通过磷酸二酯键与另一个具有3个保护的单核苷酸相连。原理与磷酸二酯法相同。只有参与反应的单核苷酸与3-末端磷酸和5-羟基的保护基团相连。2。磷酸三酯法，3。磷酸三酯的固相合成，其中第一个核苷酸的3-羟基末端固定在固体支持物上。是目前常用的合成方法。化学合成的脱氧核糖核酸片段通常在200个碱基以内。第二，化学合成的脱氧核糖核酸片段的组装，使用T4多核苷酸激酶将磷酸带到每个片段的5-末端。1.互补连接法，预先设计和合成的片段之间有互补区，不同片段之间的互补区可以形成带断点的完整双链。(2)5-末端磷酸化，(1)互补配对，(合成的DNA单链的5-末端是-OH)

4、，T4 DNA连接酶，T4多核苷酸激酶，磷酸化5-OH，完整的DNA双链，(3)连接酶连接成完整的双链，3、5、5、3、5、3、T4脱氧核糖核酸连接酶、克兰诺片段、引物、1。直接基因合成。寡核苷酸化学合成的优点。合成引物(约20个左右)，(1)mRNA含量很低，(2)部分基因较短，化学合成成本较低；(5)合成人工衔接子或接头，其包含酶消化位点的人工衔接子或接头的各种序列。EcoRI，接头，衔接子，将某个生物细胞的整个基因组切割成适当大小的片段，并将所有这些片段与适当的载体连接，并将其导入相应的宿主细胞进行保存和扩增。理论上，这些重组载体携带了生物体的所有基因，这些基因被称为基因文库。1.基因文

5、库的构建。基因文库，基因的保存和扩增第3节，(2)目前常用的载体，2。用于构建基因文库的载体的选择、载体可携带的DNA片段的大小直接影响构建完整基因文库所需的重组体的数量。载体的容量越大，DNA片段的数量就越少，所需的重组体也就越少。(1)载体要求，载体系列：容量为24kp的粘粒；容量为50kb的YAC容量为1mb的bac:(1)染色体大片段的制备；3)基因文库构建的一般步骤，超声波(300bp)或机械搅拌(8kb)。物理切割法：内切核酸酶Sau3A用于局部消化。可以获得10-30kb的随机片段。酶消化：(2)载体和大基因组DNA片段的内聚端直接相连，载体和大外源DNA片段的两端具有相同的内聚

6、端。例如Sau3A和BamHI的限制端。直接连接、人工接头或均聚物尾部。人工衔接子法，人工合成限制性酶的粘性末端片段。各种酶接头可以定制或从公司购买。，人工接头，粘性末端，CCC，CCC，末端转移酶，粘性末端，均聚物加尾部，4。基因组文库的大小，当文库包含99%的基因组时所需的克隆数。n=，ln (1-p)，ln (1-f)，p:文库包含全基因组DNA的概率(99%)，插入到f:载体中的DNA片段的平均长度占全基因组DNA的百分比，n:所需的重组载体(克隆)的数量，例如，人类基因组为3109 bp，插入And n=，ln (1-p)，ln (1-f)，=，ln (1-99%)，ln (1-f)

7、，=，4.61，g，F以基因为模板反向转录的脱氧核糖核酸称为基因。2。cDNA文库，2。构建cDNA文库，mRNA，cDNA，3，3，5，5，逆转录酶，引物，利用某一生物体的总mRNA合成cDNA，然后将这些cDNA与载体连接，将其转移到细菌细胞中进行保存和扩增，称为cDNA文库。(1)不含内含子序列。(2)可在细菌中直接表达。(3)它包含所有编码蛋白质的基因。(4)它比文库小得多，易于构建。4.构建基因文库的一般步骤，(1)总核糖核酸的提取，(3)基因文库的特征。有提取总核糖核酸的商业试剂盒。用市售寡脱氧核糖核酸纤维柱分离。从总核糖核酸中分离纯化出核糖核酸。)通过使用含有聚腺苷酸尾的基因。该

8、基因仅占总核糖核酸的1%-2%。(2)基因的分离纯化，原理，基因的分离纯化，柱，逆转录酶，基因第一链合成，逆转录酶可以以核糖核酸为模板合成脱氧核糖核酸。第一条基因链是用寡核苷酸(或随机引物)作为引物合成的。mrna、cdna、3、5、5、aaaaaa、tttttttttt、oligodt引物，以及通过碱处理或RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。基因，cDNA，3，3，5，5，逆转录酶，引物，基因，cDNA第一条链，3，3，5，5，引物，cDNA第一条链，3，5，引物，降解的基因模板，或核糖核酸，碱，和剩余的3个末端的cDNA单链通常是由合成的第二条链的脱氧核糖核酸聚合酶。cd

9、na第一条链，5，cDNA第二条链合成，DNA聚合酶，cDNA第一条链，cDNA第二条链，5，3，cDNA第二条链合成，核酸酶S1，核酸酶S1可以切断发夹结构(但这将导致cDNA中有用的序列被切断！).第一链，第二链，5，3，第一链，第二链，5，3，5，3。这种酶可以识别基因-基因杂交分子中的基因，并将其降解成许多小片段。这个小片段只是用来合成冈崎片段的脱氧核糖核酸聚合酶的引物。脱氧核糖核酸聚合酶去除引物并修复它们，然后用脱氧核糖核酸连接酶连接整个脱氧核糖核酸链。mRNA、cDNA、3，5、逆转录酶、引物、mRNA、cDNA第一链、3，5、引物、mRNA、cDNA第一链、3，5、mRNA、mR

10、NA、DNA聚合酶、DNA聚合酶、cDNA第二链、cDNA第一链、RNA或在末端转移酶的帮助下向载体和双链cDNA的三个末端添加几个c或g以成为粘性末端。5。将cDNA连接到载体：连接人工接头，粘性末端，CCC，CCC，末端转移酶，6。基因文库的大小，当一个基因文库包含99%的基因时所需的克隆数。，N=，ln (1-p)，ln (1-)，p:文库包含完整mRNA的概率(99%)，某个低丰度(少于14拷贝)的mRNA占整个细胞mRNA的比例，N:所需重组载体的数量(克隆数)，1，1，N，1，1富集特定基因的mRNA或cDNA模板。毛细管柱，探针脱氧核糖核酸，探针脱氧核糖核酸，探针脱氧核糖核酸，总

11、核糖核酸，毛细管柱，探针脱氧核糖核酸，探针脱氧核糖核酸，探针脱氧核糖核酸，探针脱氧核糖核酸，通过柱，与探针碱基互补的核糖核酸结合到柱上，其他的核糖核酸流走。特异的基因，洗脱，逆转录聚合酶链反应，原理：羟基磷灰石柱，与单链脱氧核糖核酸或双链脱氧核糖核酸结合，不与单链脱氧核糖核酸结合。(羟基磷灰石柱)，分别从表达蛋白A和不表达蛋白A的组织细胞中提取和分离总的基因。表达蛋白a的基因被合成为第一条链。然后与不表达蛋白a的总基因杂交，形成基因-基因双链。不能杂交的基因包括特异性表达的基因的单链。用羟基磷灰石柱收集单链基因，合成双链基因进行扩增、克隆和测序。A、A、B组织、总mRNA(A)、总mRNA(B

12、)、含蛋白A的mRNA、无蛋白A的mRNA、总cDNA第一链、杂交、含蛋白A的cDNA、羟基磷灰石柱、柱、吸收的RNA-DNA MRNA差异显示RT-PCR、(1)3-末端锚定引物、3-末端有两个核苷酸的寡(dT)引物(倒数第二个不再是T)。AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

13、AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATSTATT、TTT、TTTTTTT、TTTT，RT，NM，TTTTTTTTTT，5，cDNA，3，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN，引物组合：240组可以分离20000多个条带！实验结果：如果每个条带相当于一个基因，那么20000个基因基本上反映了特定细胞中的所有基因。在测序凝胶上，每组扩增出50-100条长度为100-500bp的条带。(5)随机锚定引物聚合酶链反应产物的电泳比较，240组来自不同组织的引物组合聚合酶链反应产物在测序凝胶中电泳。选择不同的条带，并进一步使用聚合酶链反应作为探针。筛选文库，找到差异基因的全长序列。1.从基因组中直接扩增，(1)提取基因组DNA作为模板，(2)根