双向电泳实验步骤.ppt

1、双向电泳、辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663、双向电泳、一、双向电泳原理二、双向电泳样品调制三、第一电泳IEF电泳四、凝胶平衡五、第二电泳SDS-PAGE六、 双向电泳辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，一、双向电泳原理、双向电泳(Two-dimensional electrophoresis )的基本原理是基于蛋白质的等电点(pI )和分子量的IEF )蛋白质的等电点第二向电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelectrophoresis，SDSPAGE )根据蛋白质分子量的大小分离蛋白质

2、。 双向电泳可以一次从细胞、组织或其他生物样品中分离出千种蛋白质，凝胶上的斑点对应样品中的蛋白质，各蛋白质的等电点、分子量与含量的信息能够通过质量分析与软件分析获得。 因此，在蛋白质组分析、疾病标志物检测、细胞差异分析、药物开发、癌研究等领域广泛应用。 辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，2:蛋白调配主要目的： (1) :细胞、组织破裂开裂(2) :蛋白质溶解与破坏蛋白质与蛋白质分子之间、蛋白质与非蛋白质之间的共享与非共享的相互作用(2) :蛋白质与非共享的相互作用(3) :避免脂质、核酸、盐等物质干扰的作用。 (4)消除4):高丰度蛋白对低分度蛋白的掩蔽作用。 (5):防止样

3、品聚焦时发生蛋白质聚集和沉淀。 (6) :蛋白质样品与第一电泳的相容性。 二、双向电泳样品制备，辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，双向电泳样品制备动物样品，(1)将组织切成细丝，放入研钵，迅速加入液氮研磨，直至组织变成粉末，均匀、明显的颗粒(2)在乳钵中加入800LB (使用前加入1 PMSF )，在充分溶解(捕集)粉末后，转移到1.5mLEP管中，以4，12000 r/min、离心20min，捕集上清液。 (3)超声波处理、核酸破碎。 各EP管的超声波为3次，每次58次，然后进行离心，收集了4，4，12000 r/min、离心20min、上清液。 (4)在3管中分注上清液，

4、每管约250L，每管再加入1mL丙酮20，沉淀一晚。 沉淀的蛋白质经4，4，12000 r/min，20min离心分离，注入上清液后，放置在干净的纸巾上自然干燥，可得到处理后的蛋白质块，-80保存备用。 (5)在干燥的蛋白质块中加入相应量的RB (具体添加量取决于蛋白质块的大小)，用枪头将蛋白质块戳小，然后反复吹走直至蛋白质完全溶解。 对于过度干燥的蛋白质块(透明状)，用50L移液管以10L为单位调整，稍微吸入RB封闭枪头，将蛋白质块重复小小，用超声波校正处理直到看不到明显的蛋白质块。 吸出4，4，12000 r/min、离心20min、上清液，转移到新的EP管。 辉骏生物：免费服务热线： 4

5、00-699-1663，二、双向电泳样品制备植物样品，(1)植物样品放入乳钵中，加入液氮研磨，组织到粉末化，如果没有均匀明显的粒子，乳钵中有小汤(2)在离心管50mL中加入萃取液8mL进行混炼，再加入饱和苯酚8mLTris，充分振荡后置于冰上，每隔5min振荡一次，合同6次，距离45000r/min，30min时，溶液分层，下层为水相，上层(3)富士充分振荡，放在冰上，每隔5min振荡一次，合订6次，4，45000 r/min，离心30min，吸出上层酚相，转移到新的15mL离心管。 重复一次苯酚提取。 (4)加入最后得到的苯酚的5倍体积的醋酸铵甲醇溶液，使蛋白沉淀，充分振动后在冰上保温，每隔

6、5min振动，修正6次，-20下沉淀一晚。 (5)将沉淀了一夜的蛋白质在4，5000 r/min下离心30分钟，丢弃上清液，加入甲醇5mL洗涤蛋白质，反复吹塑均匀后，在4，5000 r/min下离心30分钟。 重复。 辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，(6)加入丙酮4mL清洗蛋白，反复吹匀后，4，45000 r/min，离心30min。 重复一次操作。 加入丙酮3mL，均匀喷涂后，蛋白质平均分为3根1.5mLEP管，4，12000 r/min，离心20min。 倒入上清液后，放置在干净的纸巾上自然干燥，得到处理后的蛋白质块，准备保存-80。 (7)在干燥的蛋白质块中加入相应量

7、的RB (具体添加量取决于蛋白质块的大小)，用枪头将蛋白质块戳小，然后反复吹走直至蛋白质完全溶解。 对于过度干燥的蛋白质块(透明状)，用50L移液管以10L为单位调整，稍微吸入RB封闭枪头，将蛋白质块重复小小，用超声波校正处理直到看不到明显的蛋白质块。 吸出4，4，12000 r/min、离心20min、上清液，转移到新的EP管。 二、双向电泳样品制备植物样品rehydration buffer stock(RB )、辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663、Alklysis buffer(LB )、醋酸铵甲醇溶液ammonium 用甲醇制备0.1M醋酸铵，制备双轴电泳样品，辉骏生物

8、：免费服务热线： 400-699-1663，三，第一项电泳IEF电泳，1将所有样品稀释至5g/L。 2 :各橡胶条上试样液的成分，相应量的蛋白质、1%DTT、1%IPG Buffer、1 -溴酚蓝、RB调制最终体积为460L以下。 均匀混合样品溶液后，以4 12000r/min、20min离心，吸取上清液450L进行泡沫膨胀。 3 :取出水合皿，在下面铺上白色纸巾(容易观察橡胶带的膨胀情况)，调节水平准备。 从冰箱中取出干橡胶带加热(不加热的话橡胶带会变湿)。 将离心分离的样品上清装入水合皿的槽中，450L的样品液可以分为3发装入，第1发吸入160L，从槽的前端沿左右边缘装入，样品液中加入细线

9、，长度约为22cm，第3发是管中残留样品液的20L 复盖前端部分的调节室内温度为20，使橡胶带膨胀一夜(1012h )，4 :等点焦点(IEF )，等电焦点程序为S1 stp 300V 20min，S2 stp 700V 30min，S3 stp 1500V 1.3h。 S6 stp 600V 20h 5:跑完后，取出橡胶带，去除表面的填充油，在橡胶面上将橡胶带放入平衡管，将橡胶带放入-20保存。 需要运输时，用冰完全包埋平衡管保温。 辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，四，橡胶带平衡，1 :作用DDT与IAA并用，还原蛋白质的巯基，SDS使蛋白质带负电，有利于第二向SDS-P

10、AGE电泳。 2 :实验步骤(1) :取出放置有橡胶带的平衡管，在各管中加入10mL左右的去离子水，洗去橡胶带表面的靶油，除去去去离子水。 (2) :在SDS平衡液中加入100mM DTT搅拌后，每根平衡管加入8mL平衡液，平衡15分钟，去除平衡液。(3) :在SDS平衡液中加入250mM IAA搅拌后，每根平衡管加入8mL平衡液，平衡15分钟，去除平衡液。 (4) SDS平衡液： 50mM Tris-HCl (pH8.8)、6M Urea (FW 60.06 )、30 % (v/v )灰度(87 % v/v )注：在进行IPG凝胶平衡之前，必须准备第二方向凝胶。 辉骏生物：免费服务热线： 4

11、00-699-1663，五，第二向电泳SDS-PAGE电泳，1，根据实验分离片的大小选择不同浓度的PAGE凝胶2.6%C Monomer stock solution :4 resolvion 迅速在胶面上加入水饱和正丁醇使液面变平，加入时将枪头贴在玻璃长板上慢慢移动加入均匀，在所有玻璃板上加入2mL后，在玻璃板和灌浆的间隙中也分别加入2mL使内外液面变平，然后辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，43360用电泳(1)1x电泳缓冲液制备1%低熔点琼脂糖45mL，1%普通琼脂糖80mL，加入溴酚蓝溶液至1x，装入泡沫箱中准备在装有槽液的量筒中稍微冲洗，将橡胶带放入玻璃板中，将酸性

12、端向左放置，用尺子将橡胶带按压在二十字面上，使橡胶带的下端与二十字面紧密接触，不能将气泡封闭在橡胶带的下端放置玻璃板，加入槽，在槽和玻璃板的间隙加入1%普通琼脂糖凝胶，堵塞间隙，防止垂直方向漏电。 在上槽中轻轻放入上槽液(2 x电泳缓冲液)至最大刻度，用上槽液稀释2倍，配置在下槽液(1 x电泳缓冲液)中，放入下槽直至上下槽的液面变平，关闭盖，连接电极，开始电泳。 电泳条件在2W/gel 45min后变更为17W/gel，继续进行电泳，在BPB弹出二向色糊后可以停止电泳。 10 SDS电泳缓冲液、1% SDS、250 mm三基座、1.92 m灰度。 300 X溴酚蓝贮藏液、1%溴酚蓝、50mM Tris-base。 五、第二方向电泳SDS-PAGE电泳，辉骏生物：免费服务热线： 400-699-1663，六，染色，1，试染： (1)电泳结束后，用塑料尺将玻璃板翘起，用去离子水清洗玻璃板下面和胶面，玻璃杯(2) .染色：固定40%MeOH 10%HAc 30min-over night。 漂洗H2O 15min X 4次。 染色室温摇摇晃晃地停止H2O漂洗一夜，直到背景清晰为止。 染色液： (0.12%g-250、100mlh