课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、1.研究和应用微生物的前提是？ 2.实验室培养微生物关键是什么？,防止杂菌入侵，获得纯净的培养物,（1）需要为培养的微生物提供合适的营养和环境条件,复习回顾,（2）需要确保无处不在的微生物无法混入。,固体培养基、液体培养基,碳源、氮源、水、无机盐,计算、称量、溶化、（调pH）灭菌、倒平板,确保培养物不被污染,确保实验员不被污染,3.分离、纯化大肠杆菌的方法及原理？,方法：（1）利用平板划线法或稀释涂布平板法接种培养 （2）挑选单一菌落进行扩大培养,原理：不同微生物菌落特征不同,专题二 微生物的培养与应用 课题2.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,实例分析：,尿素是一种有机物，不能被农作物吸收，

2、植物如何才能利用尿素？,土壤中的细菌可以将尿素分解为氨,这类细菌可以产生脲酶,土壤中的细菌为什么可以分解尿素？,思考：怎么从土壤中分离出这些细菌呢？,阅读课本P21，感悟科学家寻找耐高温的DNA聚合酶给你的启示。你如何将土壤中分解尿素的细菌分离出来？,1.原理：,（一）筛选菌株,人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。,一、研究思路,利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选。,2.尿素分解菌分离的原理：,思考：分离土壤中分解尿素的细菌时，你将如何配置培养基( ) 加尿素 不加尿素 加琼脂 不加琼脂 加葡萄糖 不加葡萄糖 加硝酸盐 不加硝酸盐 A

3、B C D,C,能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存,此培养基能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？,学生活动下表为分离分解尿素的细菌的培养基配方，请分析、回答下列问题。,无机盐,无机盐,无机盐,碳源,氮源、碳源,不提供营养，凝固剂,水,3.选择培养基：,允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,举一反三分离下列微生物，你将如何配制培养基,无氮源的培养基,无碳源的培养基,含有青霉素的培养基,含有高浓度食盐的培养基,（1）将土壤中的固氮菌分离出来,（2）将土壤中自养微生物分离出来,（3）筛选出抗青霉素的微生物,（4）筛选出耐高浓度食盐的微生物,延伸思考,不一定

4、，只要能利用尿素的微生物都可以分离出来。如芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,1.含有尿素的选择培养基只能分离出一种分解尿素的细菌吗？,2.如何鉴定分离得到的就是能分解尿素的细菌？,在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,接种培养该细菌，若指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。（见：教材P26课题延伸）,实验探究,要验证以尿素为唯一氮源的培养基对土壤中的细菌确实具有选择作用，你该如何设计实验。,实验组:,对照组:,培养基中的氮源只加尿素,牛肉膏蛋白胨培养基,接种,接种,只生长尿素细菌,生长多种微生物,阅读课本22页统计菌落数目部分：

5、,1.微生物计数都有哪些常用方法？,（二）统计菌落数目,因为平板划线法无法较准确计数，一般只用于菌种的分离,显微镜直接计数 活菌计数法：,：利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察,为什么不用平板划线法？,在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。,a、原理：,每克样品中的菌落数(CV)M C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数， V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)， M代表稀释倍数。,b

6、、计算：,稀释涂布平板法,活学活用某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml） A. 2.34108 B. 2.34109 C. 234 D. 23.4,没有设置重复组，因此结果不具说服力。,1个平板的计数结果与另 2个相差太远,说明操作过程中可能出现了错误,设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。 在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致（30-300个），结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。 统计的

7、菌落往往比活菌的实际数目低。,2.实例分析：两位同学的结果是否准确？导致不准确的原因可能是什么？由此，你得出的结论是什么？,(因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落),练习题：用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是() A涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163 D涂布了三个平板，统计的菌落数是210、240和250，取平均值233,D,对同一细菌培养液样品分别用显微镜直接计数

8、法和稀释涂布平板法测定其菌体数量，你认为两种方法所测数据有何差异？,延伸思考,稀释涂布平板法统计出的菌落数偏小 显微镜计数法不能区分活菌死菌。,1.此实验（微生物的分离与计数）过程中是否需要设置对照？设置对照的主要目的是？,2.请你帮一帮A同学，他该怎么办？,需要，目的是排除实验组中非测试因素（培养基是否被污染，培养基中是否混有其他氮源，接种、培养过程中是否严格无菌操作等）对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,方案一：用其他同学的培养基培养A同学的土样,（三）设置对照,3.受A同学的启发，你在实验时该如何设置对照？,培养空白培养基,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同

9、，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,二、实验设计,（1）原理：,（2）实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。 （3）实验流程：,从肥沃、酸碱度接近中性的湿润土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,(一)土壤取样,取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。,实验步骤,(二)制备培养基,准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。每个稀释度下需要3(或4)个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基。 还需要8个灭菌试管和1个灭菌移液管 。

10、 将稀释相同倍数的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度 原因：不同微生物在土壤中含量不同 目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,（三）样品的稀释,问题：为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好

11、氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。 选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物

12、往往需要不同培养温度。 细菌：3037培养12d 放线菌：2528培养57d 霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,关注菌落的形态、大小、边缘、隆起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,三、操作提示,一无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品 的稀释度等。 三规划时间,1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选

13、择出分解尿素的微生物。 2.提示：选择每个平板上长有30300个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。,四、课题成果评价,1.本课题只是对分解尿素的细菌进行了初步的筛选，对菌种进一步鉴定还需借助生物化学方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂(酸性呈黄色、碱性呈红色、中性呈橙色)。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。 2. 细菌数目的测定还可以通过 滤膜法,五、课题延伸,大肠杆菌菌落呈黑色,中心有或无金属光泽,大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征,例1 下表是培养分解尿素的细

14、菌的培养基配方，请回答下面的问题：,(1)在该培养基的配方中，为微生物提供碳源的是_，提供氮源的是_。 (2)绝大多数微生物都能利用_，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解_。,(3)分析该培养基的配方，该培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？,葡萄糖,尿素,尿素,葡萄糖,该培养基对微生物具有选择作用。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。,例2 自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。 实验步骤： (1)制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。 (2)选用_法接种样品。 (3)适宜温度下培养。 结果分析： (1)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是 () A一个平板，统计的菌落数是23 B两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24 C三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26 D四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25,稀释