课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (3)

1、课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,1、实例分析：,启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的 要求，到相应的环境中去寻找。,DNA多聚酶链式反应需要耐高温（930C）的DNA聚合酶。,一、筛选菌株原理,思考1：怎样去寻找含有这种酶的微生物？,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。,2、实验室中微生物的筛选原理,一、筛选菌株原理,配方一,配方二,一、筛选菌株原理,思考2：以下培养基的C源和N源分别是什么？对微生物是否具有选择作用？,培养细菌,培养可以分解尿素的细菌,人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止

2、其他微生物生长的培养基，称为选择培养基。,3、选择培养基,一、筛选菌株原理,思考3：我们要从土壤中分离出能够分解尿素的细菌，实验过程如何设计？主要包括哪几个步骤？,1、配制培养基,二、实验过程设计,2、土壤取样,3、样品梯度稀释,4、涂布平板,5、培养与观察,制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。,湿润、肥沃，地表以下38cm。,取土样的小铁铲和装土样的的信封在使用前都要灭菌。,二、实验过程设计,3、样品梯度稀释,应在火焰旁称取土壤10g。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。,二、实验过程设计,4、涂布平板,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,分离

3、不同的微生物采用不同的稀释度。,思考：分解尿素的细菌的分离实验，我们应该选择哪些稀释度？,102、103、104、105、106,二、实验过程设计,5、培养与观察,培养不同微生物往往需要不同培养温度和时间。 细菌：3037培养12d； 放线菌：2528培养57d； 霉菌：2528培养34d。,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,思考：进行微生物观察时主要观察菌落的哪些特征？,形状、大小、隆起程度、颜色、透明度等。,微生物的培养与观察,二、实验过程设计,6、实例分析,在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时

4、，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因，提出解决方案。,原因：土样不同； 培养基污染(或者是混入了其他的含氮物质)； 操作失误。,二、实验过程设计,6、实例分析,（2）解决方案,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验。,结果预测及分析：如果结果与A同学一致，则证明A操作无误，确实是土样不同所致；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,结果预

5、测及分析：如果空白对照没有长出菌落，说明培养基未被污染；如果空白对照长出菌落，则说明A的培养基被污染。,1、显微镜直接计数：,利用血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,三、统计菌落数目,不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察。,缺点：,2、活菌计数法 原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。 常用方法：稀释涂布平板法。,每克样品中的菌落数(CV)M 其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,三、统计菌落数目,注意： 为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。 为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。 统计的菌落往往比活菌的实际数目低。,3、实例分析： 甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板，菌落数分别是80、90、100，涂布平板时均使用0.1ml菌液，试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目？,（80+90+100）/ (30.1) 105 =9 107个,细菌合成的_将尿素分解成了_。氨会使培养基的碱性_，pH_。使酚红指示剂