粗糙链孢霉的四分子分析

1、粗糙链孢霉的四分子分析,一、实验目的,1、了解粗糙链孢霉的杂交方法； 2、通过Lys和Lys杂交后代表现型的分析，了解顺序四分子的基因作图方法； 3、加深分离和交换定律的理解，了解基因转变现象。,二、实验原理,粗糙链孢霉 ( Neurosporocrassa ) 属真菌的子囊菌纲。两种不同接合型菌株的结合受一对等位基因控制，可验证分离规律。 利用粗糙孢霉Lys和Lys杂交，野生型孢子成熟较早，缺陷型子囊孢子成熟较迟的特点，观察杂交后代的表型并进行分析 ，可用于着丝粒作图。,粗糙链孢霉的生活周期（接合型与高等动植物中性别的不同）,四分子分析用于验证基因分离规律 （Lys+）（Lys-） 合子（+

2、/-） 子囊孢子1：1分离：4个黑色（+） 4个灰色（-）,顺序四分子分析用于着丝粒作图,目的基因与着丝粒之间发生重组 1、着丝粒为M1分离 2、目的基因的分离,M1分离：目的基因与着丝粒之间未发生重组，产生非重组型子囊 M2分离：目的基因与着丝粒之间发生重组，产生重组型子囊,lys C,交换型子囊与非交换型子囊的形成,非交换型子囊 M1,交换型子囊 M2,目的基因在M1分离，产生非重组型子囊 目的基因在M2分离，产生重组型子囊,+ + + + - - - -,+ + - - + + - - - - + + - - + + - - + + + + - - + + - - - - + +,非正常

3、分离子囊,基因转换：一个基因在联会过程中受到等位基因的影响而发生变化。基因转换总是伴随着染色体之间的交换,M后分离：基因转换产生不正常分离子囊,着丝粒和基因之间的重组值的计算,基因与着丝粒之间的图距为去掉的重组值,三、实验用品,1、材料：粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+。 粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-。 2、药品：琼脂、蔗糖、玉米粒、土豆、 5次氯酸钠（NaClO）、5石碳酸。 3、器具：显微镜、接种针、载玻片、试管、恒温培养箱、高压灭菌锅、滤纸、小烧杯、水浴锅。,四、实验操作流程,1、菌种活化 ：将Lys和Lys菌株分别接种在完全培养基上，28培养5d左右。 2、杂交 ：将两种亲本菌株

4、分生孢子或菌丝接种到杂交培养基上，培养57d，形成黑色子囊果。 3、子囊果处理：在有子囊果的试管中加少量无菌水，摇动片刻，把水倒入三角瓶中，小组集中煮沸，防止孢子飞扬。 4、显微观察：取一载玻片，加12滴5次氯酸钠，用接种环挑出子囊果，放在载玻片上，用另一载玻片盖上，用手指压片，压破子囊果，在低倍镜下观察。,五、实验结果与分析,1、观察一定数目的子囊果，记录每个完整子囊的类型，计算Lys基因与着丝粒距离。 2、记录你所观察到的基因转变现象。 思考题： 1、用图表示第六种子囊类型的形成。 2、假设在基因与着丝点之间发生了双交换，你的数据和计算结果会发生怎样的偏差？,实验结果,（粪壳菌子囊孢子颜色

5、遗传）,0.06,0.05,0.008,5:3,6:2,不规则 4:4,正常 4 : 4 98.82,5:3、3:5或6:2、2:6或3:1、1:3都属于不规则，说明减数分裂的4个产物中，一个基因转变为另一等位基因基因转变现象。,rare exceptions,有时出现如图结果,参考结果,六、注意事项,1、菌种活化及杂交要注意无菌操作。 2、赖氨酸缺陷型接种在完全培养基上生长不好，需要加适量赖氨酸。 3、杂交后培养温度要控制在25；30以上抑制原子囊果的形成。 4、用过的载玻片、镊子和解剖针等物都需放入5的石碳酸中浸泡后取出洗净，以防止污染实验室。,5、注意观察选择的时间 Lys子囊孢子成熟较迟，当Lys子囊孢子已成熟呈黑色时， Lys子囊孢子还呈灰色，如果观察时间过早，所有的子囊孢子都未成熟，全为灰色；观察过迟， Lys子囊孢子也已成熟，全为黑色，就不能分清各种子囊类型。 6、注意基因转变现象 偶尔观察到62、26、53、35或异常的4 ：4等分离比，是基因转变造成的。基因转变的频率一般在1%左右。,培养基的配制,马铃薯培养基（基本培养基）：也可以代替完全培养基。将马铃薯洗净去皮，切碎，取200g，加水1000ml，煮熟，然后用纱布过滤，弃去残渣，滤下的汁加2琼脂，20g蔗糖，煮融，分装到试管中。或将马铃薯切成黄豆大小的碎块，每支试管放3-4粒，再加入融化好的琼脂、蔗糖