血清蛋白质浓度定量测定.ppt

1、BCA方法最近被广泛用于定量蛋白质浓度。操作简便、快速、灵敏、准确，试剂稳定、经济、实用，抗干扰能力强。【原理】:在碱性条件下，蛋白质将Cu2还原为铜，铜与BCA试剂形成紫色络合物，测量其在562nm处的吸收值，并与标准曲线进行比较，即可计算出待测蛋白质的浓度。基本原理，BCA(双喹啉酸)蛋白质浓度定量：蛋白质在碱性环境中与Cu2络合，并使Cu2还原为铜(缩二脲反应)。BCA与铜结合形成稳定的紫蓝色复合物，其在562 nm处具有高的光吸收值，并且与蛋白质浓度成比例，从而可以确定蛋白质浓度。试剂甲：分别称取10克BCA二钠盐、20克无水碳酸钠、0.16克酒石酸钠、4克氢氧化钠和9.5克碳酸氢钠，

2、混合，调节酸碱度至11.25，加水至1L。2.试剂b: 4硫酸铜。3.BCA工作溶液：将100毫升试剂甲和2毫升试剂乙混合。操作步骤：1。摇晃溶液a并充分混合。根据样品数量，加入50倍体积的溶液A和1倍体积的溶液B试剂(50:1)配制BCA工作液，混合均匀。BCA工作液24小时内稳定。2。蛋白质标准溶液：1.5毫克/毫升蛋白质标准溶液由结晶牛血清白蛋白和生理盐水按其纯度配制而成。(纯度可通过用凯氏定氮法测量蛋白质含量来确定)；3.绘制标准曲线：取6根试管，编号后分别加入0毫升、0.02毫升、0.04毫升、0.06毫升、0.08毫升和0.1毫升标准蛋白溶液，然后在每根试管中加入去离子水至0.1毫

3、升，最后在每根试管中加入2.0毫升工作溶液。立即在涡流混合器中混合(注意不要太剧烈，以免产生大量难以消除的气泡)，并以蛋白质的蛋白质含量为横坐标，吸光度a为纵坐标绘制标准曲线。样品测定：用绘制标准曲线的方法，在试管中加入0.1毫升待测样品代替标准蛋白质溶液，然后加入2.0毫升工作溶液，立即在涡旋混合器中混合，测量吸光度a，检查标准曲线，计算待测样品中的蛋白质浓度(克/升)。【优缺点】(1)操作简单快捷，45分钟内完成测定，比经典的劳里法快4倍，更方便；(2)准确、灵敏，试剂稳定性好。BCA试剂的蛋白质测定范围为20-200克/毫升，微量BCA测定范围为0.5-10克/毫升。(3)经济实用，除试

4、管外，测定可在微孔板中进行，大大节省了样品和试剂的消耗；(4)试剂抗干扰能力较强，如洗涤剂、尿素等。它没有效果。这种方法近年来被研究者广泛用于测定蛋白质浓度。目前，市场上有BCA方法的试剂盒。BCA蛋白检测试剂盒是根据世界上最常用的蛋白浓度检测方法之一BCA法开发的，实现了蛋白浓度测定的简便、高稳定性、高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25 g/ml，最低检测蛋白量达到0.5 g，待测样品体积为120 l。稀释标准：完全溶解的蛋白质标准(5mg/mlBSA，储存于-20)，取10微升，用PBS(pH7.4等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升(样品一般可用PBS稀释)，使最终浓度为0.5mg/m

5、l。根据0、2、4、6、8、12、16和20微升，将稀释的标准品(0.5毫克/毫升)加入96孔板的蛋白质标准孔中，并加入标准稀释液至20微升。制备pH7.4等渗磷酸盐缓冲液(PBS) :氯化钠8.0克KH2PO4 0.2克Na 2HPO 412H2O 2.9克KCI 0.2克将上述试剂依次加入定量容器中，加入适量蒸馏水溶解，然后调节体积至1000毫升并调节酸碱度、6孔板底部面积9.6平方厘米、2.5毫升、12孔板底部面积4.5平方厘米、2毫升、24孔板底部面积2平方厘米、1毫升、96孔板底部面积0.32平方厘米和0.1毫升，取自司徒震强细胞培养。3、这种测定蛋白质浓度的方法近年来已被研究者广泛

6、使用。目前，市场上有BCA方法的试剂盒。总之，虽然测定蛋白质含量的方法很多，但没有完美的方法。选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件来决定。试剂A: 1 BCA二钠盐2无水碳酸钠0.16%酒石酸钠0.4氢氧化钠0.95碳酸氢钠混合调节酸碱度至11.25。2.试剂b: 4硫酸铜。3.BCA工作溶液：将100毫升试剂甲和2毫升试剂乙混合。4.蛋白质标准溶液：根据纯度用结晶牛血清白蛋白和生理盐水配制1.5毫克/毫升的蛋白质标准溶液。(纯度可通过凯氏定氮法测量蛋白质含量来确定)5。待测样品：用缩二脲法稀释。这种测定蛋白质浓度的方法近年来已被研究者广泛使用。目前，市场上有BCA方法的试剂盒。总之，虽然测定蛋白质含量的方法很多，但没有完美的方法。选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件来决定。向96孔板的样品孔中加入适量样品，并加入少于20微升的标准稀释剂。也就是说，适当稀释蛋白质样品(最好进行几次梯度，如2次、4次和8次稀释)。4.在每个孔中加入200微升BCA工作溶液，用加样枪轻轻吹混(注意：不要让气泡影响读数)，静置30-60分钟。冷却至室温后，用酶标仪测量562纳米或540-590纳米之间的其他波长的吸光度，并根据标准