课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1、课题背景：尿素CO(NH2)2的重要农业氮肥。 只有被土壤中的细菌分解为NH3才被植物吸收利用，CO(NH2)2 H2O CO2 2NH3，课题2分解土壤中尿素的细菌的分离和修正数，一、研究构想，美国黄石国家公园的温泉，(一)菌株的筛选水生耐热细菌Taq (Thermus aquaticus ) 耐高温Taq DNA聚合酶美国微生物学科书籍于1966年发现耐热细菌，1、实验室微生物的筛选原理(P21 )为人为目标菌株的生长提供了有利条件(包括营养、温度、pH等)，同时筛选抑制(1)菌株，另一方面微生物学中，允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类的微生物生长的培养基称为选择培养基。 (

2、1)筛选菌株，一、研究思路、加入青霉素的培养基细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长不含碳有机物的无碳培养基分离自营养微生物。 1 .培养基配方中，为微生物生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？ 碳源是葡萄糖，氮源是尿素，2 .分析这个处方的培养基对微生物有选择作用，如果适用的话，怎么选择？ 的双曲馀弦值。 尿素是培养基中唯一的氮源，原则上只有能够利用尿素的微生物才能生长。 阅读第22页的本课题中使用的培养基配方，如何证明该培养基具有选择性？以尿素为唯一氮源的培养基，牛肉糊剂培养基分离尿素细菌，判断该培养基有无选择性，仅使尿素细菌生长，使多种微生物生长，(2)微生物修订设5个方格中的总菌数为a，菌

3、液稀释倍数为b，1个方格中的总菌数是多少？1ml菌液中的总菌数是多少？ (1ml=1cm3=1000mm3)，5 ab 104，5 a，缺点：不能区分死菌和活菌，2，集中菌落数稀释涂布平板法，(2)微生物修订数，某个等级的菌落数统一修订表，平板，组，(取样0.1mL，稀释倍数106 )， 思考1 :如何根据平板上的菌落数推定每mL样品的菌株数，计算某稀释度下平板上的菌落数，计算平板上的菌落数的平均值，作为每mL样品的菌株数=(CV)M进行修正。 在相关校正计算中，某学生在稀释倍数106的培养基上测得的平均菌落数为234，每克样品的菌落数为(涂布平板时使用的稀释液体积为0.1 ml ) () a

4、.2.34108 b.2.34109 c.234 d.23.4 因为两个以上的细胞连接在一起，在平板上观察到的只有一个菌落。 因此，统一修正结果一般用菌落数表示，而不是用活菌数表示。 思考3 :为了提高实验结果的说服力和准确性，我们在实验设施修改时应该如何合理，在事例分析1中，由于第一个同学只涂了一张平板，没有设置重复组，结果没有说服力。 第二个学生考虑到设置重复组的问题，涂抹了3块平板，但其中1块平板的修正数结果与其他2块大不相同，表示操作中可能产生错误，不能单纯地求出3块平板的修正数值的平均值。想一想：哪个同学的结果接近真值？ 你认为这两个同学的实验有必要改进吗？ 如果需要的话，会怎样改善

5、呢？ (3)实验基本原则，1，平行重复原则，1，研究构想，实例分析2，请思考： a先生和其他同学得到的实验结果的差别这么大，请分析原因，、实例分析2，请思考：通过设置对照， 你能帮助a同学排除可能影响上述两个实验结果的因素吗一个方案：其他同学可以和a同学用同样的土地进行实验。 如果结果与a先生一致，则证明a没有错；如果结果不同，则证明a先生的操作错误和培养基的调配有问题。 实例分析，请思考：设置对照能否帮助a先生排除可能影响这两个实验结果的因素，另一个方案是不加土样培养a先生制备的培养基，作为空白对照证明培养基是否被污染实验结果很有说服力，对照设置是必不可少的，从实例来看，设置对照实验的目的是

6、什么？ 排除实验操作、培养条件等无关变量对实验结果的影响，提高实验结果的可靠性。 (3)实验基本原则，1，平行重复原则，2，对照原则，3，单一变量原则，1，研究构想实验名称：土壤中分解尿素细菌的分离和修正数实验原理：实验目的：材料用具：方法步骤： 1，组号2，处理(遵循实验设施修正的基本原则)对照原则，单一变量原则(等量) 平行重复原则可行性原则3、观察记录(设订观察记录)将表层土打捞3cm左右后取样，将样品放入预先准备好的信封中。 扫土铲和填土信封在使用前必须灭菌。 培养基的制备：制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 二、实验设施修订应在火焰旁取土壤10g。 在稀释土壤溶液过程中，各步骤应在火

7、焰旁边进行，(3)样品稀释、取样涂布、实验时在培养皿上做标记。 标明培养基的种类、培养时间、稀释度、培养物等。 取样涂层、分离不同微生物采用不同稀释度。 原因：不同微生物在土壤中的含量不同，初次实验无法掌握稀释的范围，因此选择较大的范围：稀释倍数为103107。 微生物的培养和观察在菌落修订数时，每24h修订一次菌落数。 结果选择菌落数稳定时的记录，防止因培养时间不足而遗漏菌落数。 培养微生物常常需要不同的培养温度。 细菌： 3037培养12d放线菌： 2528培养57d霉菌： 2528的温度下培养34d。 在微生物的培养和观察中，无菌操作1、铲土用的铲土样的信封在使用前需要灭菌。 2 .在火

8、焰旁取土。 将火焰附近的土样放入锥形瓶，塞上棉塞。 3 .在稀释土壤溶液过程中，每一步必须在火焰旁操作。 2 .做上记号标明培养基的种类、培养日、平板培养样品的稀释度等。 分析了是否选择三修订时间、三、操作提示、一、结合对照、培养物中有无杂菌污染及培养基进行菌落筛选。 2 .在某种稀释度下是否得到了菌落数为30-300的平板。在这个稀释度下，至少两个平板的菌落数是否接近3 .你修订的每克土壤能分解尿素的细菌菌落数是多少？接近其他同学的结果？ 如果有很大的差异，可能会考虑什么样的原因？ 四、结果分析和评价，CO(NH2)2 H2O CO2 2NH3、pH上升指示剂(酚红)变红，五、课题延伸。 方

9、法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某些细菌后，pH值上升，用脲酶、滤膜法测定饮用水中大肠杆菌数量。 将已知体积的水过滤后，将滤膜放置在伊红美蓝培养液基上进行培养。 在这个培养基中大肠杆菌的菌落呈现黑色。 根据培养基上的黑色菌落的数量，可以计算出水试料中的大肠菌的数量。 微生物修订数，(1)空气中微生物总数的检测，(2)水中细菌总数的检测，(3)牛奶中细菌的分离和修订数，(4)土壤中真菌(或放线菌)的分离和修订数，6，相关链接1 .使用选择培养基的目的() a .细菌b的培养.真菌c的培养.使必要的微生物大量繁殖的d .将某个微生物的特定性状和其他的微生物区别开的2 .能合成脲酶的微生物所必要的碳源和氮源分别是A.CO2和N2 B .葡萄糖和NH3 C.CO2和尿素d .葡萄糖和4 .以下的说法不正确的是() a .科学家从7080度的热泉分离为耐高温的TaqD