色谱柱分类与选择-内部培训资料PPT课件.ppt

1、一、色谱起源,1906 年俄国植物学家Tsweet 发现色谱分离现象,2,高效液相色谱仪的分析原理,高效液相色谱仪的结构 色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理,高压泵,进样器,检测器,色谱工作站,色谱柱,1 Basic principle of chromatographic separation 1.1 色谱分离基本原理,Partition coefficient K分配系数,硅胶颗粒基质合成步骤： 1.合成硅胶基质 2.键合配体(键合相) 3.端基封尾 end-capped,以传统方式制造硅胶色谱填料的过程: 起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即A类硅胶,90年代以后方式：orga

2、nosilica polymer 有机单晶硅聚合的硅胶，即B类硅胶,填料的端基封尾 封口残余硅羟基 减少不可逆吸附或拖尾 增加碳含量（0.1% -1%）,C18键合并端基封尾后 还能看见什么？硅羟基!即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!,单、双、三官能团键合,三官能团键合,二官能团键合,单官能团键合,键合,常用封尾end-capped ：三甲基硅氧烷,极性封尾，增加极性保留,Hypersil ODS即没有封尾 Hypersil ODS-2有封尾,由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保

3、留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。,封尾,封尾,空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷,空间位阻,极性嵌入 polar embedded,问题：下列色谱柱如何选择？,amidohexadecylsilyl silica gel Column: size : l = 0.25 m, = 4.6 mm; stationary phase: diisopropylcyanopropylsilyl silica gel for chromatography R (5 m) with a specific surface a

4、rea of 180 m2/g and a pore size of 8 nm; stationary phase: spherical octadecylsilyl silica gel for chromatography R (5 m) with a specific surface area of 170 m2/g and a pore size of 12 nm. stationary phase: aminopropylsilyl silica gel for chromatography R (5 m), stationary phase: end-capped octadecy

5、lsilyl silica gel for chromatography R (5 m), stationary phase: base-deactivated octadecylsilyl silica gel for chromatography R (3 m). stationary phase: o ctylsilyl base-deactivated silica gel for chromatography R (4 m) with a pore size of 6 nm, stationary phase: end-capped polar-embedded octadecyls

6、ilyl amorphous organosilica polymer R (5 m); Mobile phaseMix 35 volumes of acetonitrile R and 65 volumes of a 5.23 g/l solution of dipotassium hydrogen phosphate R previously adjusted to pH 7.0 with phosphoric acid R.,（答案见备注信息）,以传统方式制造硅胶（A类硅胶）色谱填料的过程: 起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）,Na2SiO3 (矿物) + 2H+,Si(OH)4 (sil

7、icic acid)+ 2Na+,硅胶颗粒 (含金属杂质!),C18/C8 bonding + endcapping,C18/C8 Reversed Phases (最终仍带金属杂质!),与键合相的疏水性作用,双重保留机理:1). 与键合相的的疏水性作用; 2). 与残余硅醇基间的离子交换作用,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,当流动相

8、pH值小于3时, 硅醇基呈中性(未解离),Base,Base,对碱性化合物的保留及严重拖尾,两实验使用相同的传统C8硅胶柱,离子交换作用,碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理,当流动相为 pH6-8时, 硅醇基带负电性(大部解离),既然pH 3时硅醇基离解受抑制，为何不在所有情况下采用酸性条件进行分离?,低pH可导致分离选择性的完全丧失!,硅胶晶格中杂质铝对硅醇基酸度的影响,质子酸,H,金属嵌入硅胶晶格中，使硅醇基的酸性大大增强,+,_,硅胶中金属杂质含量对螯合性化合物Hinokitiol峰形的影响,Minutes,2,4,6,8,流动相:20 mM Phosphate Buffer pH 3.6

9、（含 0.05% EDTA): Acetonitrile (50:50),低金属杂质,高金属杂质含量,金属杂质的存在可使得硅醇基过度活化，以至某些碱性化合物在酸性条件下仍呈现拖尾峰,分析物: Chlorpheniramine,杂质铝含量, ppm,1,2,3,4,0,100,200,300,400,拖尾因子,“高纯硅胶 ”区,流动相 : 乙腈/KH2PO4 pH 3.0 (20:80),传统型C18硅胶柱上金属杂质对碱性化合物峰形的影响,Minutes,5,15,25,35,45,Amitriptyline,Acenaphthene,Propranolol and Butylparaben,N

10、aphthalene,铝杂质含量 375 ppm Tf USP = 6.5,流动相 pH 7,如何解决碱性化合物和螯合物的峰形问题?,从修饰流动相着手改善峰形(例如使用竞争性碱TEA或离子对色谱) 1970-1980年代策略 从改善反相填料着手降低硅醇基活性 自1990年代起至今,现代色谱柱三大技术平台,亲水AQ柱 ECOSIL ODS-AQ Atlantis Dc18, T3 Synergi Hydro-RP HILIC柱 Zic-HILIC Hypersil GOLD HILIC Atlantis HILIC 柱 目的：提高极性化合物保留,宽pH色谱柱 ECOSIL ODS-Extend

11、Xbridge/Xterra C18/C8 Gemini C18 Zorbax ODS-Extend 目的：提高色谱柱pH使用范围,纯硅胶柱 ECOSIL ODS-SH Purospher STAR RP18e Symmetry C18 极性嵌入柱 ECOSIL ODS-EPS Zorbax-Bonus RP18 Symmetryshield RP18 目的：改善峰形,Tetraethoxysilane (TEOS),Polyethoxysilane (PEOS),B类超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成过程,无金属杂质的超纯起始原料,常见品牌C18柱在pH7下的性能比较,品牌,Acenaph,k,A

12、mitrip/Acenap,a,Amitriptyline,拖尾因子(美国药典法),Ecosil C18-SH,16,1.3,1.4,Inertsil ODS-2,16,1.4,2.5,Puresil C18,14,1.5,3.3,Zorbax Rx C18,16,1.8,6.0,Purospher RP-18,16,4.8,6.0,Kromasil C18 Alltima C18,19 23,1.5 3.5,9.4 13,Nova-Pak C18,16,2.3,5.5,Nucleosil C18,15,4.3,10,Hypersil ODS,11,2.8,10,Zorbax ODS,21,无

13、法测得结果!,2.6,常见品牌C18柱在pH3下的性能比较,对碱性化合物的峰对称性,pH 7,pH 3,Symmetry,Symmetry,(极佳),Inertsil,Purospher,LiChrospher RP,select B,Alltima,YMCbasic,Inertsil,Puresil,kromasil,Purospher,YMCbasic,Zorbax Rx,Zorbax Rx,Nova,-,Pak,LiChrospher RP,select B,kromasil,Puresil,Alltima,Nova,-,Pak,Nucleosil,Nucleosil,Hypersil,

14、Zorbax,Zorbax,Hypersil,(差),常见品牌柱在pH3和 pH7下的峰形优劣排序,Ecosil ODS-SH,Ecosil ODS-SH,具有极性嵌入基团的反相填料结构示意,内嵌极性基团固定相：水表面层可能机理,水 “屏蔽”层,改善与水的浸润性100%水溶液兼容 降低了碱性化合物的保留 降低了拖尾现象,屏蔽了带负电的硅羟基,极性基团增加了表面层水的浓度,C18键合相硅胶柱填料需要合适的湿润度,注意：需要有机溶剂来保证反相填料有合适的湿度, 反之停流速后易出现“疏水塌陷”问题,未湿润的孔,湿润的孔,注意：保留时间与填料表面积与配体有关。然而，如果硅胶表面未湿润，那么有效的色谱表

15、面积会减少95%，因此，减少被分析物的保留时间即等于“疏水塌陷”，记住：几乎所有的表面积都在孔内！,低比例有机溶剂或纯水溶液流动相,C18 硅胶,什么是“疏水塌陷”？,分,流动相：0.1% 醋酸水溶液,阿莫西林,Vo：被分析物没有保留,“湿润时”,“去湿后”,疏水塌陷,停流速后 (孔去湿: 3%),流动相：0.1% 醋酸水溶液,极性嵌入色谱柱：无疏水塌陷现象发生,内嵌极性基团键合相： 使用高比例水溶液流动相时色谱性能稳定,Ecosil C18-EPS Tf USP = 1.1,阿米替林,Ecosil C18-SH Tf USP = 1.4,注意：对碱性化合物而言，可以减少保留时间并且改善色谱峰

16、形,相同硅胶基质(配体不同),内嵌极性基团的配体与直链烷烃配体的比较,注: 使用相同的流动相,Ecosil C8-EPS,Ecosil C8-SH,选择性不同,呋喃唑酮(痢特灵)杂质分析,极性基团嵌入技术（屏蔽技术）的历史沿革,1990: Supelcosil pKb-100 (嵌入酰胺键), 专利 (两步合成法) 1992: Prism RP (嵌入脲结构) 和 Supelcosil LC-ABZ (两步合成法) 1993: Supelcosil ABZ+Plus (两步合成法) 1995/1996: Waters SymmetryShield RP18/RP8(氨基甲酸酯结构),专利(一步

17、合成法) 1999: Waters Xterra RP18/RP8 (氨基甲酸酯结构),专利(一步合成法) 1998/1999 (Supelco放弃了基于酰胺键嵌入技术的两步合成法专利): Discovery RP Amide C16 (一步合成法) 许多其他公司开始仿制. 2000: ECOSIL C18-EPS/C8-EPS (酰胺基十六烷基结构)(一步合成法),多种品牌色谱柱对碱性化合物的峰形比较,USP Tailing Factor (amitriptyline, pH 7),1.1,1.1,1.1,1.1,1.2,1.2,1.4,1.4,1.4,1.5,1.6,1.8,1.8,1.8

18、,1.9,2.1,2.4,2.6,3.4,4.3,5,5.6,6.4,9,10,1,3,5,7,9,Ecosil C8-EPS,Ecosil C18-EPS,SymmetryShield RP8,SymmetryShield RP18,YMC-Pack PolymericC18,Luna C18(2),Supelcosil ABZ+Plus,Discovery RP Amide C16,ECOSIL C18SH,Luna C18,Zorbax Bonus RP,YMC-Pack CN,Nova-Pak CN HP,YMC-Pack Pro C8,Symmetry C18,Symmetry C8

19、,YMC-Pack Pro C18,Nova-Pak Phenyl,Zorbax Extend C18,YMC-Pack Phenyl,YMC-Pack ODS-A,Waters Spherisorb ODSB,Nova-Pak C18,Waters Spherisorb ODS2,Bondapak C18,Atlantis dC18 Column:揭开人类酿酒历史之谜 (2004),古埃及十二世王 Tutankhamen (约公元前 1346-1327),1922年发掘Tut王墓葬时所发现的具象形文字的残片, 疑为盛酒器皿上的标签说明,Tartaric Acid (酒石酸) Syringic

20、 Acid (丁香酸): 是红葡萄中的两个内源性标记物,AQ柱的极性保留秘诀,表面峰端,键合密度,键合相连接方式,微孔大小,防微孔脱水,峰形,保留性能,柱寿命,1、极性封尾 2、极性嵌入 3、低碳载量 4、保留硅羟基 5、增加极性嵌入键合相,AQ色谱柱的特点,对极性与非极性化合物的优异保留特性 在100水溶液流动相中运行保持色谱性能稳定 峰形优异 超低键合相流失，质谱兼容 酸性条件下稳定性良好 在高水相、低pH条件下具有较长的色谱柱寿命 极佳的色谱柱间重现性,Atlantis dC18柱对极性化合物的优异保留性能,对嘌呤碱表现良好峰形(因对填料进行了彻底封端),Compounds: 1. Cy

21、tosine 2. 5-Fluorocytosine 3. Uracil 4. 5-Fluorouracil 5. Guanine 6. Thymine 7. Adenine,Conditions Column: AtlantisTM dC18 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase A: H20 Mobile Phase B: ACN Mobile Phase C: 100 mM CH3COONH4, pH 5.0 Flow Rate: 1.0 mL/min Gradient:Time Profile (min)%A %B%C 0.0 90 010 10.0 84 61

22、0 Injection Volume: 10 L Temperature: 30 oC Detection: UV 254 nm Instrument: AllianceTM 2695, 2996 PDA,尿嘧啶(Uracil) 是测试反相柱最广泛采用的死体积标记物, 但在Atlantis dC18柱上具显著保留,Atlantis dC18:丙毒(丙烯酰胺)分析,色谱柱：Atlantis dC18色谱柱 5m，2.1150m m 流动相：0.1%甲酸+甲醇=98+2 流速：0.2mL/min 进样体积：20ml,数据来源： 北京CDC,条件 色谱柱： AtlantisTM dC18 4.6 x

23、 150 mm, 5 m 流动相 A: 0.1% TFA 水溶液 流动相 B: 0.1% TFA 乙腈溶液 流速: 1.4 mL/min 梯度:时间 梯度组成 (min)%A %B 0.0100 0 5.0 97 3 6.0 85 15 10.0 80 20 12.0 0 100 25.0 0 100 进样体积: 10.0 L 温度: 30 oC 检测: UV 268 nm 仪器: AllianceTM 2695, 2996 PDA,极性与非极性化合物保留的完美平衡,化合物：浓度(g/mL) 1. L-抗坏血酸(VC)19.6 2. 烟酸 (niacin) 9.8 3.硫胺(VB1)19.6

24、4. 吡哆醛39.2 5.吡哆醇(VB6)39.2 6. 叶酸 (VB11)23.5 7. 咖啡因 9.8 8. 核黄素 (VB2) 3.9 9. 视黄醇(VA)19.6 10. 生育酚 (VE)39.2 11. 麦角钙化甾醇(VD2) 9.8,Grumbach, Diehl,对于水溶性维生素的极佳保留,对于脂溶性维生素 不过度保留,注：无需离子对试剂！,问题,AQ柱有哪些不足之处？,HILIC,Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (HILIC) 亲水作用液相色谱,其他HILC柱 硅胶柱 氨基柱 丙基酰胺柱 亲水键合硅胶柱（多羟基等）,问

25、题： 为什么不考虑SCX或SAX,HILIC柱特性,HILIC 柱用于在AQ柱上依然无有效保留的场合 分离机制为“反反相色谱”技术 HILIC 柱与C18柱上的出峰顺序刚好相反 由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离，在LC/MS应用中的检测灵敏度比AQ柱上显著提高 可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样，省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦。,HILIC保留特性 1、固定水，利用氢键作用 2、离子交换作用,洗脱能力： water methanol ethanol propanol acetonitrile acetone,三聚氰胺和三聚氰酸同时检测,FDA推荐Zic-HILIC,突破高纯硅胶柱局限性

26、的必要性,硅胶柱pH适用极限,0,10,20,30,40,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,k,pH,硅醇基解离,带负电荷,硅醇基未解离,碱性化合物具良好峰形 但保留不足,对碱性化合物的保留增强,但需严格控制流动相pH 值。封端不佳的反相柱会面临峰拖尾的问题。,硅醇基完全解离, 硅胶基体逐步溶解！,碱性化合物呈中性，保留强,峰性佳。,需要全新的柱技术,宽pH值色谱柱突破硅胶柱应用禁区的有力手段,优点,缺点,无机基质 (C18 硅胶),机械强度高 柱效高 保留稳定,有限的pH应用范围 对碱性分析物拖尾 化学不稳定性,有机基质 (高聚物),很宽的pH应用范围 无离子型作用

27、化学稳定性好,机械强度不佳 柱效低 保留行为难以预测,宽pH值色谱柱,宽pH值色谱柱的几种类型,双齿键合，Agilent,四乙氧基硅烷 (TEOS),硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷 (MPEOS),甲基三乙氧基硅烷 (MTEOS),Waters 专利技术 荣获2000年全球 R 60% B Injection volume: 10L Temperature: 30oC Detection: UV 230 nm Instrument: AllianceTM 2690, 996 PDA,1. p-Toluamide 2. Lidocaine 3. Ibuprofen,Grumbach, Diehl,Co

28、lumn: XTerra RP18 4.6 x 100 mm, 5 m Mobile Phase A: 20mM Ammonium Acetate (pH 5.0 to 5.8) or 20mM Ammonium Bicarbonate (pH 6.8 to 7.0) Mobile Phase B: ACN Flow Rate: 0.5 mL/min Isocratic Mobile Phase Composition: 40% A; 60% B Injection volume: 10L Temperature: 30oC Detection: UV 230 nm Instrument: A

29、llianceTM 2690, 996 PDA,分析方法对pH敏感度的测试- 糟糕的结果,分析方法对pH敏感度的测试- 优异的结果,杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值,Note: Column Particle, Temperature and % Organic Held Constant,0.1,1,10,100,0,2,4,6,8,10,12,14,pH,k,Acetaminophen,Ibuprofen,Nortriptyline,Lidocaine,Doxepin,Imipramine,p-Toluamide,Mobile Phase: 35% MeCN, 65%

30、20 mM Buffer,硅胶柱,Xterra 4.6 x 50mm 3.5 m. 柱温： 30C. 流速: 2.0 mL/min. 检测: 254nm. 进样体积: 20 l. 运行时间: 20 min. 流动相: A: 100mM 甲酸铵 pH 3.64. B: 水; C: 甲醇 样品浓度: 20 g/mL,Time (min) %A %B %C 010 90 0 110 50 40 3 10 46 44 1010 46 44 1110 90 0 15 10 90 0,Triamterene Chlorthalidone Althiazide Furosamide Benzthiazide

31、 Probenecid Ethacrynic acid Bumetanide Canrenoic acid,Wagrowski, Tran,利尿剂分离,样品复杂：样品中含有9种化合物 基于起始梯度实验的结果，优化了色谱柱类型，有机相比例及pH 平梯度获得最终满意分离结果,pH 9.0条件下的溶剂选择性：等度分离条件探索,Wagrowski, Tran,3,5,利尿剂：pH 9条件下最终的等度分离条件,流动相: A: 乙腈; B: 甲醇; C: 水; D: 100 mM 甲酸铵, pH 9.0 等度条件: A: 13 %(乙腈); B: 4 %(甲醇); C: 73 %(水); D: 10 %(