2010漓院PCR.ppt

1、1.以细胞为基础的载体法,基因克隆简单的说指的是大量产生基因片段的技术。一般有两种方法可以实现基因扩增：,2.使用PCR技术,Kary B. Mullis,J3 聚合酶链反应,P161,P161,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction) 简称PCR，它是模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外通过使用一对与靶DNA两端互补配对的引物模拟细胞内DNA复制的机制来扩增DNA片段的技术。,1.PCR反应的过程：,DNA解链（9095变性）,退火（4565 ）,链延伸（72 ）,9095,72,保温（72 ）,72,2535 cycles,PCR技术的特点？,2.PCR

2、反应体系：,PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（Mg2+ ）,标准的PCR反应体系： 10buffer 3 l dNTP 2 l 引物 1 1 l 引物 2 1 l模板DNA 2 l Taq 酶 1.0 U Mg2+ 2 l ddH2O 19 l,1. 模板 / template DNA,P162,原则上凡能提供多于个目标分子的DNA都可用作PCR模板。 常规PCR只能扩增至少已知目标分子两端序列的DNA（引物设计的基础）,无论模板DNA来源如何，只要已知一些序列信息从而能设计出引物的DNA就能应用于PCR扩增。 P162,无论模板DNA来源如何，只要已知一些序列信息从而能设

3、计出引物的DNA就能应用于PCR扩增。,思考：PCR的模板有哪些？,2. 引物/ Primers,P162,PCR技术之所以能够在短时间内快速准确地将目的序列扩增，其关键在于反应体系中的引物； 引物设计在不违反引物设计原则的基础上时，最为简单但不失为有效的方法是以该目的基因5端约20个碱基序列做5端的引物，以该基因3端20个碱基顺序的互补序列做3端引物 ； 一对引物在模板DNA上的结合点之间的距离决定了扩增片段的长度（1kb之内是理想的扩增跨度；2kb左右是有效扩增跨度，3kb很难获得有效的扩增）。,?,只要能引导DNA相向合成即可作为PCR扩增的引物。,思考：具体PCR的引物如何确定？,三、

4、PCR扩增产物的分析 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。,1. 凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 (图.) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 分子杂交 是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。 3. 序列分析,四、PCR 延伸技术,1、反向PCR 2、RT-PCR 3、RAPD 5、AFLP 6、SSR,1、反向PCR： InversePCR。主要用于解决扩增与已知序列相邻的未知DNA片段。原理：用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板DNA，再

5、将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。 克隆已知DNA片段周边的未知片段，即染色体步查.,P160,2、RT-PCR：反转录PCR，其模板为RNA包括mRNA、 tRNA、rRNA和病毒RNA。 ReversetranscriptasePCR，即以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆mRNA的5和3末端序列，从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。 用逆转录酶将RNA反转录为cDNA； 以cDNA为模

6、板进行PCR。,3 RAPD / 随机扩增多态DNA,RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)技术是建立在PCR 基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。 RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。,RAPD以PCR为基础，核心是DNA片段的扩增，与常规PCR不同在于引物。常规PCR需要一对引物，每个引物分子1530nt，引物顺序根据待扩增的基因两端的顺序设计，因此要进行PCR时，必需知道待扩增基因的顺序。而RAPD分析时，只需要一个引物，长度为10nt左右，引物顺序时随机的，因而可在被检对象无任何

7、分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析。,单引物扩增是通过一个引物在两条DNA互补链上的随机配对来实现的。在基因组DNA分子内可能会存在或长或短被间隔开的颠倒重复序列，那么在两条单链上就各有一个引物结合的部位，构成单引物PCR扩增的模板分子。如果引物的核苷酸序列很短，退火温度又较低，引物与模板颠倒重复序列的结合机会就会增多，产生若干单引物PCR扩增产物，形成该引物的特异图谱。不同DNA中这种颠倒重复序列数目及间隔的长短不同，扩增的条带就不同，即出现多态性。,图 罗汉果暴鹏品种DNA用引物S90的 RAPD扩增结果 1到8表示暴鹏的8个不同的植株,RAPD 分子标记,AFLP（Amplifie

8、dfragmentlengthpolymorphism）是在RAPD和RFLP技术上发展起来的DNA多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。 同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。,4 AFLP / 扩增片段长度多态性,AFLP的基本原理是：以PCR为基础，结合了RFLP、RAPD的分子标记技术。把DN

9、A进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3端有3个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 PCR 产物分离分开这些扩增产物，从而产生 DNA 指纹，用荧光法或银染染色法均可检测之。,模板DNA制备基因组DNA酶切接头连接选择性预扩增选择性扩增变性PAGE 银染获取图像数据处理 （mov.）,AFLP 分子标记,5 SSR标记/简单重复序列标记 又称微卫星DNA多态性，即由二核苷酸、三核苷酸或四核甘酸串联重复的拷贝数目不等而出现的

10、多态性。 根据每个SSR（simple sequence repeat）两侧一般是相对保守的单拷贝序列， 依此设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳，比较扩增带的带型，就可检测到不同个体在某个SSR座位上的多态性。,SSR-PCR聚丙烯酰胺凝胶电泳结果,SSR 分子标记,为研究某一基因的功能、生产基因工程药物或研制DNA疫苗等，都必须用PCR方法获得目的基因，然后将其克隆至合适的载体；在进行转基因植物或动物研究时，最后要鉴定被转入植物或动物是否获得了外源基因，也需用PCR进行鉴定。,PCR在临床上的应用主要是检测病原体，包括患者是否受到某种

11、病原体的感染，食物中各种病原体的含量是否超标。,1. 基础研究,2.PCR在临床上的应用,五. PCR技术在实践中的应用,3.在法医学中的应用 犯罪检测中的血痕、唾液斑、人体组织等DNA分析进行个体的识别和亲权鉴定。,4.分子考古学,主要是一些追溯性研究，如古生物DNA分析；在生物分类学中对生物的遗传物质进行分析，从而了解生物的进化过程。,3、概念:RAPD；AFLP；RT-PCR；Inverse PCR;SSR,2、PCR与细胞内DNA复制有何异同点？,1、以下不属于PCR的应用的为（ ）。 RAPD B. AFLP C. SSR D. S1酶作图,?,Thanks!,若要扩增大肠杆菌K12碱性磷酸酶基因（AKP基因），试根据其编码序列选择合适的引物。,?,正向引物： 5-ATGTCACGGCCGAGACTT- 3 反向引物： 5-TTTCAGCCCCAGAGCGGC- 3,P163,设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30个核苷酸。 引物中G+C含量以40-60%为宜, ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列. 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端末位碱基不要选用A。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,各 种 热 循 环 仪,