课题3　血红蛋白的提取和分离 (10).ppt

1、课程名称： 血红蛋白的提取和分离 年级：高中二年级 科目：生物 教材：选修一 生物技术实践 全一册 版本：人教版2007年1月第二版 单位：广东梅县东山中学 主讲教师：邓淑媚,血红蛋白,亚铁血红素基团,血红素： 功能：每个亚铁血红素基团可以从肺部结合1分子O2到组织细胞，从组织液中结合1分子CO2至肺部再排出体外。,血红蛋白呈红色。P66,红色,2条肽链,2条肽链,4个 亚铁血红素基团,血红蛋白的提取和分离 步骤,1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定,选择合适的样品,人们用人、猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白，原因是什么？,哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，无DNA ，杂质少，血红蛋白含

2、量高，便于提取。,哺乳动物的血液,1.样品处理,（1）洗涤红细胞 目的： 方法： 原因：,去除杂蛋白（主要是血浆蛋白）。,注：洗涤次数不可过少。,低速短时间离心,速度越高、时间越长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。,操作： 吸取上层透明的黄色血浆；,盐水洗涤：用5倍体积的质量分数为0.9的NaCl溶液（等渗溶液）洗涤；,再次低速短时间离心；, 重复多次，直至上清液已无黄色，表明洗涤干净。,（2）破碎红细胞，释放血红蛋白,操作：蒸馏水 + 40体积的甲苯 置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟。,作用 蒸馏水： 甲苯： 搅拌：,低渗涨破红细胞；,有机溶剂，溶解细胞膜；,使红细胞和蒸馏水、甲苯充

3、分接触，机械力加速细胞破裂。,将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。,（3）分离血红蛋白溶液,（不需低速短时间离心）,方法：,除去样品中分子量较小的杂质。,透析目的：,2.粗分离,透析,透析袋的作用： 小分子杂质能通过透析袋，大分子蛋白质不能通过透析袋，从而对蛋白质进行粗纯化。,缓冲溶液,含义,在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用； 具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。,配制方法,在血红蛋白的提取和分离过程

4、中使用什么缓冲液？使用该缓冲液的目的是什么？,磷酸缓冲液。,目的：模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。,方法：,实例：葡聚糖、琼脂糖。,凝胶,别名：,性质：一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道。,含义：根据蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离不同的蛋白质。,3.纯化,分配色谱法,凝胶色谱法,凝胶色谱法原理,分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程较 ，移动速度较 。 相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。,当不同的蛋白质通过凝胶时，分子量较小的蛋白质容易 的通道，路程较 ，移动速度较 ；,

5、进入凝胶内部,长,慢,凝胶外部,短,快,凝胶色谱法分离蛋白质的原理,大于凝胶颗粒空隙直径，被阻挡在颗粒的外面,小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部,垂直向下移动,在颗粒内部 无规则运动,较快,较短,先洗脱出来,较慢,较长,后洗脱出来,凝胶色谱操作 流程：,凝胶色谱柱的制作 凝胶色谱柱的装填 样品的加入和洗脱,装配好的凝胶柱,注意： 1.凝胶色谱柱的直径大小不影响分离效果，但直径过大造成洗脱液体积大，样品稀释度大； 2.凝胶色谱柱的高度与分离度有关。,凝胶的预处理： 沸水浴法：沸水浴加热12h，可加快 干凝胶的膨胀，除去微生物，排除胶粒内的空气。 色谱柱的填充： 尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡

6、；洗脱液不能断流。,如果装填凝胶色谱柱时出现气泡和洗脱液流干的现象，怎么办？,重新装填。,正确的加样操作：贴壁加样；使吸管管口沿管壁环绕移动；不要触及并破坏凝胶面。,样品加入与洗脱,你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,实验结果分析与评价,能。 凝胶色谱柱中红色区带均匀、狭窄、平 整，随洗脱液缓慢流出 红色区带歪曲、散乱、变宽,成功,失败,收集到的纯化后的血红蛋白,4.纯度鉴定,含义：,方法：,电泳法,带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。,原理:,在一定pH下，蛋白质分子的某些基团解离后带上正电或负电。在电场的作用下，带电分子会向着与

7、其所带电荷相反的电极移动。 由于待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,1. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移 速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、 形状不同。 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各 种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，使其迁移速率 完全取决于分子的大小。,分类,最常用的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。,样 品 处 理,方法：离心除去血浆 目的：去除杂蛋自,红细胞的洗涤,释放血红蛋白,粗分离,方法:凝胶色谱法,纯化,原理:相对分子质量

8、不同的分子在凝胶柱中 的移动速度不同 结果:相对分子质量大的分子先洗脱出来,纯度鉴定：,小结：血红蛋白的提取和分离,方法：蒸馏水涨破 目的：释放血红蛋白,分离血红蛋白,方法：离心 目的：分离血红蛋白溶液,方法：透析 目的：除去小分子杂质,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,1.红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2和CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题： （1）血红蛋白的提取和分离一般可分为四步：_、粗分离、纯化和_。 （2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。 加入柠檬酸钠的目的是_。,样品处理,纯度鉴定,防止血液凝固,以上所述的过程即是样品处理，它包括红细胞的洗涤、_、_。 （3）收集的血红蛋白溶液要进行粗分离，其方法是_。 （4）然后通过_将样品进一步纯化，最后经_进行纯度鉴定。样品纯化的目的是_。,血红蛋白的释放,分离血红蛋白溶液,凝胶色谱法,透析,电泳法,将相对分子质量较大的杂蛋白除去,（5）电泳利用了待分离样品中各种分子_的差异以及_、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。,分子本身的大小,带