地高辛标记系统.ppt

1、地高辛标记系统，地高辛引物DNA标记和检测起始试剂盒I，地高辛结构，地高辛标记和检测原理，使用不同方法将地高辛配基-11-dUTP掺入新合成的探针DNA或RNA链中或在寡核苷酸末端探针与靶DNA杂交后，地高辛标记的探针用地高辛抗体与碱性磷酸酶或其它缀合物相连的方法进行检测根据与地高辛抗体相连的不同缀合物，进行荧光检测(抗地高辛-荧光素，罗丹明的方法)， 化学发光检测(抗dig-AP和CSPD或CPD-star)或显色检测(抗DIG-AP和NBT/bcip或其他底物)揭示了探针的杂交位置，并采用随机引物标记法将地高辛-11-dUTP掺入新合成的DNA链中。 反应系统包含六个碱基的随机引物、DNT

2、P(在碱性条件下含有不稳定的地高辛配基-11-dUTP)、克兰诺酶、反应所需的缓冲液、随机引物标记和地高辛标记系统的特征。标签和检测技术。带有安全标签的探针可稳定保存一年，混合溶液可重复使用多次，与放射性同位素标记法相同。与杂交技术类似，高灵敏度和低背景可以标记脱氧核糖核酸、核糖核酸或寡核苷酸。与放射性同位素标记法不同，它是无害的。安全产生的废物不需要特殊处理。它需要很短的分析时间。稳定探针、地高辛标记和检测步骤、探针标记和标记效率测定。DNA杂交免疫分析的转移和固定洗去膜上的探针并再次杂交。基本操作要求、清洁的工作环境和试剂：(1)试剂应高压灭菌；(2)含有SDS的试剂应过滤并灭菌；(3)T

3、WEEN20应添加到预灭菌试剂中。器具应该是干净的：使用前必须清洗干净。处理尼龙膜时要小心。(1)戴无尘手套；(2)用干净的镊子夹住膜的边缘，根据探针模板DNA的要求，质粒DNA的纯度要高。最好用高纯度质粒DNA分离纯化试剂盒进行纯化，或用苯酚/氯仿提取除去残留蛋白。用H2O溶解纯化的模板。用作探针模板的脱氧核糖核酸应该是线性的，大于100个碱基。如果模板DNA是5kb，它将被带有4个碱基的限制性酶切割成更小的片段(切割后将被纯化)。模板量为10ng-3g。如果要检测复杂基因组中的单拷贝基因，标记模板的最小量应为300纳克(探针浓度：25纳克/毫升杂交溶液)。如果进行基因组DNA的southe

4、rn印迹，克隆到载体中的DNA应该被消化，然后通过琼脂糖电泳分离或通过聚合酶链反应扩增，并且获得的片段需要通过试剂盒纯化。理想的双端双向可控硅开关比为1: 3。由DIG-dUTP标记的探针可以插入20-25 bp，其基于模板的不同片段和具有不同长度的DNA片段，并且可以检测0.03-0.1 pDNA。沸水浴或98干浴10分钟，使脱氧核糖核酸变性为单链，并在冰浴中快速冷却。将高浓度引物(1#试管)混合均匀，取4 l加入变性DNA试管中，混合均匀，离心。在37孵育1小时或过夜(最长不超过20小时)。停止反应，加入2L 0.2m乙二胺四乙酸(ph 8.0)或65加热10分钟。标记步骤(10l)，用无

5、菌去离子水将1g模板DNA补充至8 l。沸水浴或98干浴10分钟，使脱氧核糖核酸变性为单链，并在冰浴中快速冷却。将高浓度引物(1#试管)混合均匀，取2 l加入变性DNA试管中，混合均匀，离心。在37孵育1小时或过夜(最长不超过20小时)。停止反应，加入2L 0.2m乙二胺四乙酸(ph 8.0)或65加热10分钟。探针标记效率检测的目的是确定杂交中使用的探针的正确数量。太多的探针剂量将导致太深的背景，太少的探针剂量将导致没有杂交或弱杂交。在检测过程中，用地高辛标记的探针系列将被稀释并放在尼龙膜上。同时，地高辛标记的对照DNA将用作对照标准，并在杂交温度下孵育过夜；用地高辛抗体进行免疫检测，并根据

6、BNT/BCIP显色步骤进行显色；比较颜色显影试剂制备(1)，洗涤缓冲液： 0.1m马来酸，0.15m氯化钠；酸碱度7.5(20)；0.3%(v/v) Tween20。15-25稳定。去除未结合的抗体。马来酸缓冲液： 0.1M马来酸，0.15M氯化钠；用氢氧化钠(固体)调节酸碱度至7.5(20)0 15-25稳定。封闭溶液的稀释。检测缓冲液： 0.1M Tris-HCl，0.1M Nacl，15-25稳定。将ph值调整到9.5。tebuffer : 10mm毫米tris-HCl，1毫米EDTA，ph 8.0.15-25稳定。停止颜色反应。试剂制备(2)，封闭溶液：用马来酸缓冲液10稀释试剂6

7、#(10封闭溶液)，制成1个工作溶液，即每9ml马来酸缓冲液中加入1ml 10封闭溶液，混合均匀，即可使用。抗体溶液(ab)溶液：是膜上的非特异性结合位点，离心4#试剂，按15000或110000的比例加入封闭溶液，可在2-8下保存12小时.(每10毫升封闭溶液加入1微升抗体)。与地高辛标记探针结合。显色底物溶液：从试剂5#中取出100微升至5毫升检测缓冲液，避光，立即使用。显示抗体结合位点，在理想条件下检测试剂盒的Dig-High Prime DNA标记和标记产量，定量探针，并根据上表中探针标记的理想产量将标记的探针稀释至1ng/l。例如，在1g，20l系统中使用初始模板1h后，理想的标记量

8、为850ng，探针的理想标记浓度为850 ng/20l=42.5 ng/l；然后将1l标记的产品41.5l H2O混合均匀，得到1ng/l探针稀释液。试剂盒提供的对照DNA稀释至1纳克/升(初始浓度为5纳克/升)。将上述稀释的2-9号试管的对照DNA和探针DNA分别在1l点膜120下固定30分钟或紫外连接3-5分钟，并将膜置于装有20毫升马来酸缓冲液的塑料容器中。将膜置于10毫升封闭溶液中，室温下放置30分钟，室温下放置2分钟；室温下将膜放入10毫升抗体溶液中30分钟，用10毫升洗涤缓冲液洗涤两次；每次在10毫升检测缓冲液中平衡2-5分钟；将膜放入2ml新制备的彩色基质溶液中，在暗室中进行显色

9、。在颜色发展的过程中不要摇晃。斑点或条带显示后，用50毫升无菌双蒸水冲洗膜5分钟，拍照，分析定量结果，染色至0.1微克对照DNA，比较标记探针与对照DNA的染色，计算地高辛标记DNA的量。如果0.1微克探针和对照稀释点都显色，那么探针标记是理想的。如果0.1微克对照显色，0.1微克标记的探针不显色，但0.3微克显色，然后计算探针浓度(约理想浓度的1/3)，以确定杂交过程中添加了多少探针(25纳克探针/毫升杂交溶液)。如果0.1微克对照显色，但0.3微克标记的探针斑点不显色。探针标记效率低的原因及解决方法如下：1 .标记条件不合适，重新标记，但标记时间延长至过夜，用相同量的模板进行标记，但系统扩

10、大，将系统中其他扩大的模板放入沸水中变性；2.模板不纯，仅使用高纯度的模板，用推荐的试剂盒制备模板纯化模板：苯酚/氯仿提取、醇沉、DNA转移和固定。基因组用常规方法消化和电泳。将脱氧核糖核酸转移到带正电的尼龙膜上，在120120下固定30分钟或在80下短暂洗涤膜2小时；或者将薄膜放入浸有10的不锈钢的滤纸中。不能通过紫外线交联立即使用的尼龙膜应干燥并储存在2-8。注意电泳、膜转移和预杂交。在电泳过程中，最好指向大约5l地高辛标记的标记。在电泳过程中，脱氧核糖核酸的量不应太大。否则，一些降解的脱氧核糖核酸片段将与探针杂交，这将造成深刻的背景。在电泳过程中，不要在凝胶或缓冲液中加入电子束进行变性和

11、中和。30分钟的处理可分为215分钟。操作尼龙膜时，随时戴上无尘手套。用镊子接触薄膜边缘时，严禁短路，不要让所有吸水纸弄湿。重量根据膜的大小从200克到500克不等，面积较小的膜可以直接放在胶水上。如果尼龙膜很大，可以浸泡在水中，然后放入20SSC中进行平衡。在膜转移之后，尼龙膜被漂洗2SC以避免杂交过程中的背景预杂交，并且缓冲液在杂交过程中覆盖膜。如果尼龙膜需要多次检测，必须确保尼龙膜在任何时候都不会干燥。杂交及杂交后洗膜注意事项，使用正确的杂交温度(使用DIG EasyHyb，DNA: DNA 3742c，RNA:RNA 68C，RNA:DNA 50C)防止尼龙膜干燥，在准备下一步处理的试

12、剂前不要倾倒使用中的溶液。使用合适的探针浓度。如果探针和目标DNA之间的同源性低于80%，在热洗过程中使用较低的温度(如60C)。热洗前，将膜洗涤液预热至热洗所需温度，配制杂交液，计算杂交温度。DiG Easy Hyb:将64毫升无菌去离子水倒入试剂7#瓶中，在37下摇动5分钟。计算出的杂交温度通常为37-42。TM=49 . 820 . 41%(G)-(600/I)(I=成对杂交的长度)。托普。=Tm-20至25，杂交，预热一定体积的DiG Easy Hyb(10毫升/100平方厘米膜)至杂交温度37至42.预杂交30分钟。在没有探针的情况下，只需将膜放入杂交溶液中42至完全湿润。(此过程可

13、延长至数小时)变性：将Dig标记的探针(约25纳克/毫升)放入沸水浴或98干浴锅中5分钟，然后在冰上快速冷却。(不能用碱变性！)将变性探针加入预热的DIG Easy Hyb(3.5毫升/100平方厘米)中，充分混合以避免起泡。倒出预杂交溶液，加入探针和DIG Easy Hyb的混合溶液。继续在42下温浴6小时至过夜(单拷贝探针)。注：含探针的DiG Easy Hyb杂交液可重复使用。杂交后，可以在-20的离心管中保存，并重复使用几次。使用前只需在68下处理10分钟。不要煮沸DiG Easy Hyb杂交溶液，清洗膜，并在室温下用2SSC和0.1%SDS洗涤5分钟。0.5SSC，0.1%SDS 6

14、5-68，轻轻摇动15分钟，洗涤两次。免疫检测、试剂制备和探针标记效率测量所有反应都在15-25C下进行，并轻轻摇动。如果膜需要重复使用，任何时候都不要让膜干燥。操作步骤(室温下进行):1杂交和膜清洗后，用马来酸缓冲液(清洗缓冲液，缓冲液1)浸泡1-5分钟；2在100毫升1号缓冲液(缓冲液2)中孵育30分钟；3将抗体DIG-抗原结合物稀释至150微升/毫升(1:5000) 4用20毫升抗体溶液处理膜30分钟，5用100毫升马来酸酸洗膜15分钟，清洗两次，6在20毫升检测缓冲液(缓冲液3)中平衡2-5分钟，7用10毫升新制备的彩色底物溶液处理膜5分钟，将其放入塑料袋或盒子中，并将其置于黑暗中。在显色过程中注意不要