基因工程的一般过程与技术 (3).ppt

1、基因工程的基本操作程序,1,基因工程基本操作的四个步骤,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,（前提）,（核心）,（关键）,（保证）,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,请举出三个以上的例子,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,请阅读P9第一和二两段,也可以是一些具有调控作用的因子,一、目的基因的获取,（一）从基因文库中获取目的基因,1.基因文库：概念见P9,2.基因文库的分类:,种类,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,部分基因文库：只

2、包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,（先建立基因文库，再从中筛选；）,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,导入受体菌中储存,基因组文库,3、构建基因文库,（1）构建基因组文库,某种生物的单链mRNA,单链互补DNA,双链cDNA片段,导入受体菌中储存,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,（2）构建cDNA文库,3.构建基因文库,基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,注意：,基因文库中不是直接保管相应基因，而是保存受体菌，菌中含基因。,4、从基因文库直接获取目的基因,怎样从基因文库中获取目的基因呢？,（

3、1）获取目的基因的根据：,如：根据基因的核苷酸序列； 基因的功能； 基因在染色体上的位置； 基因的转录产物mRNA； 基因翻译产物蛋白质等特性。,4、从基因文库直接获取目的基因,（2）用DNA探针从基因文库中获取目的基因,不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。,4、从基因文库直接获取目的基因,（2）用DNA探针从基因文库中获取目的基因,不需要模板，但需要知道序列，来构建探针。,也可以用PCR方式从基因文库中获取目的基因,为什么要构建基因文库？直接从含目的基因的 生物体内提取不行吗？,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是唯一的方 式。如果所需要的目的基因序列已知，就可以通过PCR方式

4、从含有该基因的生物的DNA中，直接获得，也可以通过反转录 ，用PCR方式从mRNA中获得，不一定要构建基因文库。但如果 所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列 的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这 种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种 生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得 到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,（二）、利用PCR技术扩增目的基因,（二）、利用PCR技术扩增目的基因,前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列。,以便合成引物。,原理：利用DNA双链复制原理,过程：,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095

5、双链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075在Taq酶作用下，合成互补的新DNA链,注意：双链DNA中，G和C比例越高，DNA变性温度越高。,（二）、利用PCR技术扩增目的基因, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _.,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,有一段已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,耐热的DNA聚合酶（Taq酶）,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍

6、地扩增,二、利用PCR技术扩增目的基因,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物处延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,利用PCR技术扩增目的基因,2020/8/14,20,33.(8分)请回答基因工程方面的有关问题： （1）利用PCR技术扩增目的基本因，其原理与细胞内DNA复制类似（如下图所示）。图中引物中为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年

7、高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。,从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占比例为 。 在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。,15/16,三,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,引物1,引物2,Taq酶,Taq

8、酶,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点,第2轮结束,（2）设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如下图），请分别说明理由。,第一组：_ _,引物I和引物II局部发生碱基互补配对而失效,引物I自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的

9、。2012年1月15日，汉水丑生标记。,“汉水丑生的生物同行”超级群大型公益活动：历年高考题PPT版制作。本课件为公益作品，版权所有，不得以任何形式用于商业目的。2012年1月15日，汉水丑生标记。,目的基因的mRNA,单链DNA (cDNA）,双链DNA (即目的基因),反转录,合成,1）反转录法： 以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2）人工化学合成法 ：,（三）、人工合成目的基因（在DNA合成仪中合成）,根据已知的

10、氨基酸序列合成DNA,基因比较小，核苷酸序列已知,二、基因表达载体的构建基因工程的核心,目的：,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,编码区：,能转录，编码蛋白质,非编码区：,不编码蛋白质,能调控遗传信息表达,2020/8/14,33,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子,外显子,与RNA聚合酶结合位点,编码区：,非编码区：,外显子：,内含子：,能编码蛋白质的序列,不能编码蛋

11、白质的序列,2020/8/14,34,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,启动子,原核,真核,基因的结构,2020/8/14,35,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,2020/8/14,36,2、表达载体的组成 启动子 终止子 目的基因 标记基因等,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,3.过程:,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达

12、载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,1、构建重组质粒时，需用 切割 含目的基因的DNA和载体。目的是 。,切割含目的基因的DNA和载体并非只能用同一种限制酶。,2、为防止载体与目的基因自身环化，应该怎么做？,3、目的基因与载体成功连接的基础是什么？,4、目的基因的插入位点不是随机的。,目的基因的插入不能破坏载体上自身需要的基因片段， 以及其上的标记基因，且插

13、入在启动子和终止子之间。,5、受体细胞不同，基因表达载体的构建也会有 差异。,基因工程载体的构建需要考虑的因素：,（1）基因的特点：若来自动物的目的基因含有内含子， 不能用于转基因植物； 若基因产物是糖蛋白，该基因在原核生物中 的表达蛋白不具备天然的活性； （2）要选择强启动子或组织特异性启动子； （3）要有选择标记基因；,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,Ca2+处理法,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,

14、1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点：经济、有效,（2）基因枪法 （3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注 射 法 程序：,3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法：,大肠杆菌,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,（一）、检测,1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,.首先取出转基因生物的基因组DNA .用含目的基因的DNA片段用放射

15、性同位素等作标记,以此做探针 .使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中,（1）方法:,DNA分子杂交,（2）过程:,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,归纳步骤,（二）、鉴定（个体生物学水平）,2、检测目的基因是否转录出了mRNA,3、检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法:,分 子 杂 交,方法:,抗原抗体杂交,过程: 用上述探针和转基因生物的mR

16、NA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA,思考与探究：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,2020/8/14,53,（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强

17、子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,2020/8/14,54,思考与探究2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,2020/8/14,

18、55,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,思考与探究：,2020/8/14,56,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,2020/8/14,57,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了