食品第二章-光谱及色谱.ppt

1、第二章 光谱及色谱分析,一、光谱产生的原理,室温下物质主要处在它们的电子能级和振动能级的基态。当不同能量的电磁波照射物质时，物质的分子或原子吸收一定波长的电磁波后从基态跃迁到激发态，然后这些激发态通过在各个方向上以相同的或较低的频率发射出所吸收的辐射，或者通过“无辐射”弛豫释放能量，一般在10-8s左右回到基态。,二、紫外-可见吸收光谱,1、概述 紫外-可见吸收光谱（ultraviolet-visible absorption spectra)是分子吸收紫外-可见光区10-800nm的电磁波而产生的吸收光谱，简称紫外光谱（UV）。 其中10-190nm为原紫外区（真空紫外区），190-400n

2、m为近紫外区（石英紫外区），400-800nm可见光区。 分子中价电子经紫外或可见光照射时，电子从低能级跃迁到高能级，此时电子就吸收了相应波长的光，这样产生的吸收光谱叫紫外光谱。,可以跃迁的电子有：电子, 电子和n电子。跃迁的类型有： *, n *, *, n *。, *，对应10-190nm的远紫外区； n *, *, n *，对应190nm以上的近紫外区和可见光区； 常见的紫外谱图波长范围为200-400nm。,既然一般的紫外光谱是指近紫外区，即 200-400nm， 那么就只能观察 *和 n *跃迁。也就是说紫 外光谱只适用于分析分子中具有不饱和结构的化合物。,紫外-可见吸收光谱的特点,

3、测量灵敏度和准确度高； 应用范围广； 对多种金属元素和非金属元素及其化合物都能进行测定 能定性或定量测定大部分有机化合物； 仪器价格便宜； 操作简单快速。,2、基本原理,通过测定吸收池中溶液对某个波长范围单色光的吸收强度，可以获得紫外-可见吸收光谱。实际的波长范围是190-400nm(紫外区)和400-780nm(可见光区)。,透射比（透光率）T：,以透光率对波长的函数作图，即得到所需样品的光谱图，可以通过透射率进行定量和定性分析，但透光率并不直接正比于样品溶液中有吸收的待测组分浓度，而是吸收带的强度（吸光度）正比于吸收池中光照部分吸光质点的数目。,吸光度A： Lamder-Beer定律： A

4、正比于光吸收池厚度b(cm)、溶液浓度c(mol/L)以及摩尔吸光系数L/(molcm)。 对于给定的体系，在低浓度(c0.1mol/L)时，A和样品浓度之间存在线性关系。但在高浓度时，由于样品内分子间距离变小，其相互作用增强并影响电荷分布，这种分子间的微扰明显地影响待测组分捕获特定波长的能力， 可能发生变化，使之偏离线性工作曲线。,3、仪器,（1）光度计 单道系统：仅用一个检测器，单色器缓慢扫描通过光谱时，它依次测量每一个分辨单元的强度。高分辨率时对应较窄的狭缝，200-400nm用氘灯，400nm以上用钨灯。 多道系统：阵列检测器（n个硅二极管），所有强度的光谱被同时测量，测量时间减小至1

5、/n，信噪比增加 倍。 不需要窄的狭缝，200-800nm均使用氘灯。,（2）滤光片,在光度计中，用一个或多个干涉滤光片代替贵重的单色器元件，使得系统适合于在指定波长下的特定应用。 图2-4是典型的光纤光度计的实验装置，适用于可见光范围，不需要将样品装入吸收池再放入光度计，而是将光度计放在样品中，进行原位样品测量。,4、操作条件,（1）样品制备 样品需要有代表性 为了防止由于浑浊溶液的光散射所产生的“吸收”，有必要先对溶液进行澄清处理。 参比池溶剂的选择 （2）分析操作 确定比色池,（3）测定波长的选择 最好选择在待测组分的最大吸收波长处测定，因为此处吸光度值不随波长变化，且灵敏度高，更符合L

6、amder-Beer定律。,5、标准曲线,根据标准曲线可确定待测组分的浓度与吸光度之间的关系，标准溶液最好采用与待测样品相同的试剂同时制备。,6、仪器误差对吸光度测定精密度的影响,（1）仪器误差：仪器噪声。 （2）在极高或极低的透光率范围内测定的误差较大，通常选用中间值的透光率测定。 （3）一般分光光度计上定量测定的最佳吸光度范围为0.2-0.8（或透光率15%-65%）。通常待测样品的吸光度应在小于1.0取值。,三、荧光光谱,1、概述 当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外线停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。,2、荧光光谱

7、分析,荧光光谱法的灵敏度比一般的吸收光谱法高1-3个数量级，所测得的信号是待测组分由激发电子弛豫到其对应的基态时发射的电磁辐射。 激发和钝化过程是同时发生的。对每个单一分子体系，都有一个供样品激发的最佳波长和另一个用于检测荧光发射的更长的波长。用于激发和发射的波长取决于待测体系的结构和化学性质。 荧光仪和荧光分光光度计中包含两个波长选择器：一个用于激发光束；另一个用于发射光束。 当激发态的物质与气体分子碰撞时可产生荧光猝灭现象。,荧光束辐射能(PF): 其中：PF:荧光比色池产生的光束的辐射能； ：荧光量子效率或量子产率（等于荧光物质吸收辐射后所发射的荧光的光子总量与吸收激发光的光子总数的比值

8、）； P0：入射光束的辐射能； P：投射出的光束的辐射能。 量子产率对任何一个给定系统都是定值。,其中：摩尔吸光系数，L/(molcm); b光程，cm; c待测组分的浓度，mol/L。 当待测组分的浓度很低时，bc0.01，PF可写为： 进一步归类为： 其中比例常数 假设待测组分的浓度很低，且其他参数不变，此时荧光信号直接正比于待测组分浓度,四、红外光谱和拉曼光谱,红外光谱和拉曼光谱都属于分子振动光谱。 （一）红外光谱 1、概述 红外光谱是固体或液体或气体对不同频率的红外辐射吸收形成的光谱。,2、红外光谱的基本原理,1）电磁光谱的红外区域 近红外光谱12500-4000cm-1(0.8-2.

9、5m) 红外光谱 中红外光谱4000-400cm-1 (2.5-25m) 远红外光谱400-10cm-1 (25-1000m),用于O-H、N-H、 C-H 等官能团的定量分析,有机化合物分子的振动跃迁基频,分子的转动光谱以及重原子成键、氢键和一些络合物、超分子化合物的非共价键的振动光谱,2）分子振动 一个分子如果沿着它的电荷分布方向振动时，其电荷分布也就是电偶极矩会发生变化，则这个分子可以产生红外辐射吸收。 伸缩振动 造成偶极矩变化最重要的振动： 弯曲振动 变形振动,3）影响分子振动频率的因素,式中： v振动量子数(0,1,2,)；h普朗克常量； k键力常数，N/cm；m1、m2原子重量。,

10、分子处于振动基态(v=0)，分子吸收电磁波后从基态跃迁到第一激发态(v=1),此时吸收的辐射频率正好等于键的初始频率，这种跃迁的吸收频率称为基频。 分子吸收2倍或3倍基频的辐射频率，跃迁到第二激发态或第三激发态(v=2或3)。由振动基态到第二激发态的吸收频率称为倍频或泛频。 当电磁波能量正好等于两个或更多基频跃迁能量的总和时，则可能同时激发两个倍频或多个基频振动到相应激发态，这种吸收称为和频。 如辐射电磁波的能量等于两个基频跃迁能量的差时，所产生的频率等于这两个基频频率之差的吸收谱带，称为差频。 合频：和频和差频的统称。,3、中红外光谱,1）中红外光谱仪 色散型红外光谱仪 傅里叶变换红外光谱仪

11、 红外显微镜,2）样品的制备技术,液体样品：选用光程为0.01-0.1mm液体池 固体样品： 气体样品：使用气体池测定。,固定池,可拆池,其他特殊池,压片法,糊状法,溶液法,薄膜法,衰减全反射法,3）中红外光谱的应用,有机官能团的吸收谱带 综合吸收峰位置、谱带强度、谱带形状及相关峰的存在可反映出各种官能团的存在与否。 一般将红外区分为官能团区（3700-1350cm-1）和指纹区（1350-650cm-1）两部分。,中红外光谱的表征,定性分析,采用计算机检索或通过与中红外建立的标准谱图比较，寻找与待测样品化合物最匹配的化合物。 定量分析 灵敏度较低，误差较大； 样品不用分离，也不受样品状态的限

12、制。,4、近红外光谱,近红外光谱(near infrared spectroscopy, NIR)归属于中红外光谱基频的倍频及合频，只有中红外光谱的基频在2000cm-1以上的振动才能在近红外区出现一级倍频。 食品分析在近红外光谱测定的波长范围为0.7-2.5m。,1）漫反射技术测定的原理,漫反射是一部分光透过样品表面后进入样品内部，并经样品颗粒反射回到样品表面。漫反射以0-180的任何角度从样品表面辐射，每一次辐射都与样品发生相互作用，样品中的化学组分也可能吸收部分辐射。 漫反射光包括样品组分和各化学成分的结构信息，采用特定波长下的能量的吸收值来表示。 样品颗粒的大小和形状直接影响辐射进入或

13、离开样品表面的光量。,2）NIR区的吸收谱带,红外光谱主要归属于中红外基频的倍频及合频，因此强度较弱。但食品中的主要成分中通常含有-OH、-NH、-CH等基团，在NIR区域均可观察到足够的强度。,3）仪器,近红外光谱根据样品的不同类型可分别测定反射率和透光率。其中反射方式主要用于固体或粉末样品的测定。,大多数食品样品的制备是将其紧密填充在样品池中的石英窗上，这样就提供了一个可发生反射的光滑、均匀的表面。 反射率R=I/I0 I设定波长下待测样品的反射光强度； I0参比物在相同波长下的反射光强度。 R值通常情况下以lg(1/R)表示，反射率测定有时也可用相邻波长所得反射率的差值或推导值表示，即l

14、gR2-lgR1,或2lgR2-lgR1-lgR3。 NIR液体样品通常采用透射法测定。,4）NIR光谱的定量分析,NIR光谱谱峰较宽，样品中各种成分的吸收重叠严重，因此定量时每种成分需要在2个或2个以上波长处测定才可靠。 组分含量(%)=Z+alg(1/R1)+blg(1/R2)+clg(1/R3)+ 式中的每一项表示在不同波长下，用相应的系数经多次测定得到的光谱测定值，每一个系数和截距采用多元线性回归方程确定。,4）NIR光谱的定性分析,采用判别分析方法，比较未知样品的NIR光谱与标准样品NIR光谱的差异，然后讲样品归类于光谱最相似的官能团。,5）NIR光谱的在食品分析中的应用,谷物和油料

15、种子种蛋白质、水分和含油量的测定。 鲜肉和加工肉制品、家禽和鱼类制品中的水分、蛋白质和脂肪的测定。 食品中糖类和有机酸的测定。,（二）拉曼光谱,红外光谱是吸收光谱，而拉曼光谱是散射光谱。 1、拉曼光谱的原理 瑞利散射散射光的波长与入射光波长相同。 拉曼散射效应当光子与分子发生非弹性碰撞时，在大于和小于入射光波长的两侧出现一系列散射线，这种现象称为拉曼散射效应。 斯托克斯线若分子处于振动能级的基态，在与光子碰撞进行能量交换后，分子被激发到较高的不稳定的准激发态，然后又回到振动的第一激发态，此时发射的光子能量小于入射光光子的能量，就产生斯托克斯线，其频率为：,反斯托克斯线若光子与处于第一振动激发态

16、的分子发生碰撞，分子将一部分能量交给光子而回到振动基态，则散射光频率大于入射光频率，产生反斯托克斯线，其频率为：,2、拉曼光谱的特征谱带及强度,拉曼活性取决于振动中极化度是否变化，只有极化度有变化的振动才是拉曼活性的，及拉曼效应与产生诱导偶极矩变化的振动相联系。 拉曼光谱中官能团谱带的频率与其在红外光谱中出现的频率基本一致。极性强的基团极化度很低，将产生强的红外光谱、弱的拉曼光谱，反之亦然。,3、拉曼光谱的应用,有利于提高重原子的振动信息； 对红外吸收很弱的碳碳三键、碳碳双键、C-S、S-S等键的伸缩振动及其他对称振动的模式都有很强的拉曼散射强度。 拉曼光谱制样简单，很多情况下，样品不需要处理

17、。 水可作为溶剂。,五、质谱,1、概述 质谱是使样品分子（或原子）在电离室中带上电荷，这种将分子转化为离子的过程称为离子的过程称为离子化或电离作用，产生的离子经过质量分离器在电场和磁场作用下聚焦，收集到的离子按质荷比(m/z)和相对丰度的大小记录下来，排列成质谱。根据离子的产生，裂解和测定的结果可以解析其分子质量或结构信息； 质谱法可以用于测定和鉴定未知化合物； 质谱按其研究对象可分为同位素质谱、无机质谱和有机质谱。,2、有机质谱仪,（1）概述 当具有一定能量的电子流轰击原子或分子时，或者失去一个价电子（偶尔也可失去一个以上的电子）成为一个带正电荷的分子离子，多余的能量可导致键的断裂，形成许多

18、碎片。带正电荷的分子离子及碎片离子按质荷比的大小依次排列成谱图被记录下来，得到质谱图。 质谱图纵坐标代表离子的相对丰度，横坐标表示质荷比（m/z），对单电子离子而言即为离子的质量值。,有机质谱仪,低分辨质谱仪,高分辨质谱仪,离子峰都是整数,精确度达原子质量四位以上小数值,组成有机化合物的各种元素除12C外则都不是整数，质子和中子结合成原子核时，有一部分质量转化为结合能而造成“静电荷亏损”。因此尽管某一原子中的质子、中子和电子数目是另一原子的质子、中子和电子数目的整数倍，但是他们的质量比确不是整数，即使由相同数目的质子、中子和电子组成的不同分子也具有不同的质量。,（2）质谱仪器,质谱仪器按记录方

19、式不同可分为质谱仪和质谱计，有机质谱多用质谱计。,进样系统,样品的导入方式有静态法（又称直接进样法）、直接插入探针法和动态平衡法三种。 直接进样法：是在高真空条件下，使气体或挥发性液体的纯组分直接进入离子源。 直接插入探针法：将固体或沸点较高的液体纯样品放在探针杆通过样品加入口放进离子源，样品在离子源中被加热汽化。 动态平衡法：适用于混合样品，首先将样品分离成单组分，然后用质谱仪分析。,离子源,离子源：产生离子的装置； 电子轰击（EI）离子源：最早且至今广泛使用的离子源。GC-MS中，化合物受到由铼或钨组成的灯丝发射的电子轰击，分子受激化后离子化并形成失去较低电离电位价电子的分子离子。分子离子

20、化后具有较高的内能，可能进一步裂解为小分子碎片和各种离子碎片。 离子化形成的负离子在排斥极被中和，随真空泵抽出，正离子则被排斥极推出离子源，通过加速聚焦板上的小孔将离子聚焦为散色角较小的离子束，经出口狭缝进入质量分析器。 其他离子源：化学电离源、场电离和场解析、快速原子攻击源、液体二次离子质谱、基质辅助激光解吸电离、电感耦合等离子电离、电喷雾电离、热喷雾电离、热喷雾电离、大气压化学电离。,质量分析器,任务：根据m/z分离带电荷的碎片，并精确地指出各碎片的质荷比。 常用的类型：四级杆、离子阱、飞行时间质谱、扇形磁质谱分析器、傅里叶变换离子回旋共振质谱。,扇形磁质谱分析器,四级杆质谱分析器,离子阱

21、,（3）质谱的解析,离子的主要类型：分子离子、碎片离子、同位素离子、多电荷离子、负离子、离子-分子反应生成的离子和亚稳离子等。 质谱的解析 基峰或基准离子：质谱图中具有最高丰度或强度的碎片（m/z）； 分子离子即母离子，具有最高的质量数。,（4）气相色谱-质谱,（4）液相色谱-质谱,LC-MS接口的基础是通过加热，然后快速将这些蒸汽在减压下膨胀，这样可将热能用于蒸发溶剂以达到完全去除溶剂的目的，并且不会使LC流出物中的热不稳定物质发生分解。,电喷雾电离（ESI）,向喷雾区引入一股逆向的氮气流可以促进雾状液滴的脱溶剂过程。而在内村的弹性石英毛细管与金属毛细管与金属毛细管之间增加一股同轴的助雾化气

22、流可使液体流量提高到2mL/min，这可使HPLC与质谱直接联用。,大气压光电离(APPI),六、原子光谱,原子光谱是指利用原子（包括离子）所发射的辐射或辐射与原子（或离子）的相互作用而进行样品分析的一类方法。 原子吸收光谱(AAS) 原子光谱法 原子发射光谱(AES) 原子荧光光谱(AFS),（一）原子吸收光谱,1、概述 1）概念 （1）共振（吸收）线：原子在吸收合适频率的光后（受光能激发），其最外层电子可跃迁到不同能级的激发态。当电子从基态跃迁到能量最低的激发态（即第一激发态）时，所产生的吸收谱线称为共振吸收线（简称共振线）。 （2）特征谱线：由于各种元素的原子结构和外层电子排布不同，不同

23、元素的原子其电子从基态跃迁至第一激发态时，吸收的能量不同，因而各种元素的共振线不同，各有其特征性，因此这种共振线被称为元素的特征谱线。 （3）锐线光源：能发射出半宽度小于吸收线半宽度谱线的光源。,2）原理 原子吸收光谱是基于自由原子对辐射的吸收，通常选择一定波长的辐射光源，使之正好与某一元素的基态和激发态能级差相对应。 基态自由原子对辐射的吸收导致基态原子数的减小，辐射的吸收值与基态原子浓度有关，即吸收与待测元素浓度有关。 从基态跃迁到第一激发态所需的能量最小，这种跃迁最易发生。对于大多数元素来说，共振线是元素的最灵敏线，常用共振线作为分析线。通过测定辐射吸收的量，可获得待分析物的含量。 在一

24、定浓度范围内，基态原子数与共振吸收线的强度成正比，因此可利用吸收线的强度进行定量分析，利用特征谱线的波长进行定性分析。,测量峰值吸收的条件： 光源发射线的半宽度小于吸收线半宽度； 通过原子蒸汽的发射线中心频率应恰好与吸收线的中心频率v0相重合。,3）原子吸收光谱仪,原子吸收光谱仪包括四大部分：光源、原子化系统、分光系统、检测系统。,光源,采用空心阴极灯作为电源，空心阴极灯的阴极材料是待测元素的纯品，给空心阴极灯施加适当电压时，即可发射出改元素的特征谱线； 空心阴极灯优点：只有一个操作参数，发射的谱线稳定性好，强度高而谱线宽度窄； 空心阴极灯缺点：每测一种元素，都要更换相应的待测元素的空心阴极灯

25、。,原子化系统,作用是将试样中的待测元素有效地转变成基态原子蒸汽，待测元素由化合物离解成基态原子的过程，称为原子化过程。 火焰原子化法 试样原子化方法 电热原子化法 非火焰原子化法 （石墨炉原子化器） 冷原子化法 （氢化物原子化装置） 电热原子化法适合于易形成难熔氧化物的元素的测定； 冷原子化法适合有些元素在火焰原子化吸收中灵敏度很低，不能满足测定要求，火焰分子对其共振线产生吸收。,分光系统,由色散元件（棱镜或衍射光栅）、反射镜和狭缝组成。 A.但光束型 B.双光束型 检测系统,4）原子化吸收光谱的特点,优点： 测定灵敏度高； 应用范围广； 仪器较简单，操作方便，分析速度快 测量精度高 缺点：

26、 测定某种元素需要该元素的空心阴极灯每测一个元素就需要一盏灯，不利于同时测定多种元素； 对一些难熔元素测定的灵敏度和精确度都不够高； 非火焰原子化法虽然灵敏度高，但是精密度和准确度不够理想，有待进一步改进提高。,2、原子吸收分析方法,1）食品样品的前处理 火焰AAS法要求将待测试样处理成溶液，需要将样品进行消化处理，以除去样品中的有机质。 湿法消化：向样品中加入强氧化剂，将有机物中的C、H、O、N转变成为CO2、H2O蒸汽和含氮气体，并挥发出去，而待元素保留在溶液中。 干法消化：使样品现在较低温度（80-150C）下炭化，在送入马弗炉中（一般500C左右）灰化，利用氧气的氧化作用破坏有机质。最

27、后讲灰分用硝酸等溶剂溶解，处理成溶液。,2）定量分析,标准曲线法 配置一组合适的浓度梯度的标准溶液系列，并由低浓度到高浓度依次测定标准溶液的吸光度A，绘制标准曲线。然后在相同的实验条件下，测定待测试样溶液的吸光度，用内插法由标准曲线求出试样中待测元素的含量。 标准加入法 是向几个相同量的试样（至少4份）溶液中分别加入一定浓度梯度的标准溶液，并由低至高测定其吸光度A，以标准溶液的浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘图。曲线不通过原点而相应的截距正是待测元素产生的吸收值，将该直线外延至横坐标相交，交点读数的绝对值即为试样中待测元素的浓度cx.,3）实验器具,所有的器具均应使用塑料或玻璃制品，试管及器皿在

28、使用前必须用酸浸泡，并用双蒸水洗净，干燥后待用； 实验用水除可用双蒸水外，也可用电阻率8k的去离子水，石墨炉法对水的要求更高，需电阻率800k的去离子水。 3、原子吸收分光光度计在食品分析中的应用,（二）原子发射光谱,1、概述 1）原理 AES是原子的外层电子受到外界能量激发后，由基态过渡到不同的激发态，处于激发态的电子不稳定，当其回到基态时，以光能的形式释放出多余的能量，因此就得到一条波长与辐射能量相对应的发射谱线。 由激发态直接回到基态所发射的谱线称为共振线，由第一激发态回到基态发射的谱线称为第一共振线，第一共振线通常是最强的谱线，即最敏感的谱线，故其是AES分析中最常用的分析线。,处于高

29、能量激发态的电子可不直接回到基态，而是回到为光谱线选择定则所允许的较低能量状态，从而发射出各种波长的谱线。 谱线强度与待测元素的含量有关，故谱线强度是进行定量分析的依据。,Ni:单位体积内处于高能级Ei的原子数； Aij:Ei、Ej两能级的跃迁概率； h:普朗克常量； Vij:发射谱线的频率。 Ni和N0遵守波尔兹曼分布定律，将波尔兹曼分布式代入上式中得： 其中gi、g0：激发态、基态统计权重； k:波尔兹曼产量。,元素谱线的相对强度I1/I2与改元素在样品中的浓度c的关系如下所示： I1/I2=acb即lg(I1/I2)=blgc+lga 其中a与样品的蒸发、激发过程及样品的组分等有关的参数

30、； b与谱线的自吸收有关的参数。 浓度很高时，b趋于0，此时谱线强度与样品浓度无关； 一般浓度时，I1/I2与c的关系较复杂，b不是常数，但b1; 只有当待测元素浓度较低时，无自吸收存在，b=1，谱线强度与浓度成正比。,2）原子发射光谱仪,原子发射光谱仪由激发光源、分光系统、检测系统三部分组成。 激发光源,激发光源提供能量使试样蒸发、解离、原子化和激发跃迁发射谱线。激发能量可由热、光、电、无线电波（电感耦合等离子体ICP）等产生。 ICP由高频发生器、等离子炬管和雾化器组成。,分光系统 将气态原子激发产生的发射光谱信号按波长的大小顺序分离展开成线光谱，分光元件可以是棱镜或光栅。 检测系统 光电

31、倍增管(PMT)代替光谱板作为检测器。,3）AES的特点,可以同时进行多元素的测定，并优于AAS，且分析速度快； 分析的选择性高； ICP-AES可分析难以原子化的难熔化合物，优于火焰AAS； ICP-AES的分析浓度范围宽； 灵敏度高； 消耗试剂少； AES无法测定常见的非金属元素O、N、卤原子，且ICP-AES仪器昂贵，也不能测定固体样品。,2、AES分析法,1）定性分析 铁光谱比较法 2）定量分析 3）样品处理,七、高效液相色谱,1、概述 2、高效液相色谱仪器的组成 五个主要部件：输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录仪/数据系统。,（1）输液泵,输液泵的作用是输送流动相（流速一般为0.5

32、-2.0mL/min），主要使用恒流泵，往复式柱塞泵使用较多。 单体泵等度HPLC洗脱 梯度洗脱在一个色谱分析周期中，将两种或两种以上的不同极性的溶剂，随时间按一定程序改变比例，以达到连续改变流动相极性的目的。 低压梯度洗脱 高压梯度洗脱,（2）进样器,（3）色谱柱,色谱柱是色谱分析的核心。HPLC分析对色谱柱的要求是性能稳定、柱效高、柱容量大、分析速度快、适应溶剂范围广。 柱组件 HPLC柱填充料 要求：形成色谱床，参与或不参与实际的分离过程、颗粒直径范围窄、良好的化学稳定性、有足够的机械强度、能耐受在填充和使用过程中的高压。 排阻色谱：分析物与填充料之间不发生其他相互作用。 吸附色谱：填充

33、料同时起到了载体和固定相的作用。,（4）检测器,将洗脱液中的组分浓度（或质量）变化转换成电信号。 固定波长型 紫外-可见光检测器 可变波长型 二极管阵列检测器（） 荧光检测器灵敏度高 测定色谱柱流出液的折光指数的变化。 折光指数检测器 通用检测器，灵敏度低 对环境温度敏感，且不能采用梯度洗脱,（）记录仪和数据处理系统,电子积分仪自动判断每个色谱峰的开始、最高和结束时间，给出保留时间、峰高、峰面积。,3、高效液相色谱中的分离模式,（1）正相色谱 固定相是极性吸附剂；流动相是由非极性溶剂，可加入一些极性稍强的改性剂，以增加溶剂的洗脱能力和选择性。 （2）反相色谱 非极性固定相和极性流动相。 辛基柱

34、（C8） 化学键合相 十八烷基柱（C18） 分析物由于和非极性固定相发生疏水相互作用而被保留，其洗脱顺序是极性强的化合物先出峰，极性弱的后出峰。,（3）离子交换色谱 流动相通常是水溶性缓冲液，通过调节流动相的离子强度和（或）pH，就可控制分析物的保留时间，逐步增加离子强度是常用的梯度洗脱方法。 （4）空间排阻色谱 仅由分析物分子大小的差异来实现。 亲水性排阻色谱：凝胶过滤色谱 疏水性排阻色谱：凝胶渗透色谱,4、高效液相色谱分析方法的建立,（1）色谱分析模式的选择,（2）色谱分析条件的选择和优化,色谱柱 仪器条件的选择 检测器 其他 流动相 色谱分析参数的优化 柱温 检测波长 样品处理步骤的选择 色谱分析方法的评价,4、高效液相色谱法在食品分析中的应用,（1）糖类的分析 （2）脂肪酸的分析 （3）氨基酸、肽和