南京科捷液相知识讲座.ppt

1、欢迎光临,日程安排 HPLC 维护 Younglin HPLC 日常维护 常见问题解答FAQ 日常使用及维护现场演示 韩国英麟机器北京代表处技术服务中心 赵紫来 (O,HPLC 故障诊断技术,I. I. 流动相的相关问题,检测器背景过高, 有时引起基线溢出.,溶剂的级别及处理方法,由于除去了有机或无机污染物，所以使用纯水对系统是非常理想的. 现在的纯水系统 都可以给出水中总有机碳的值.,流动相可能引出的问题,梯度洗脱时出现鬼峰!,溶剂级别及处理方法,如果水的质量很差，在梯度洗脱时，有可能出现鬼峰!,溶剂级别及处理方法,不同的分析及HPLC流动相级别,溶剂级别及处理方

2、法,注意HPLC级别的溶剂只允许有低UV吸收的杂质存在. 使用前，所有流动相都应该经0.45um滤膜过滤.,如果溶剂有背景吸收, - 线性范围会下降 - 噪音会增加 - 基线的稳定性会受影响。,溶剂级别及处理方法,在配置，处理HPLC级别溶剂的注意事项 :,1. THF 分析级的THF包含butylated hydroxy toluene (BHT) 作为抗氧化抑制剂. 因为 BHT 有很强的紫外吸收, 所以在HPLC级别的THF中没有BHT. 因此, HPLC级别的THF 必须储藏在冷暗的地方，尽量避免氧化. 积累了大量的有机氧化物可能会引起爆炸.,溶剂级别及处理方法,2. 氯仿 Chlor

3、oform 分析级的氯仿包含 3% 乙醇，以防止产生碳酰氯这样的有毒气体. 然而，像乙醇，水在正相分离中可以使硅胶去活，从而导致保留时间不稳定。 HPLC 级的氯仿不包含作为稳定剂的乙醇.因此，一旦打开盖子，就应放到冷暗的地方保存，以避免产生有毒气体 .,流动相可能引出的问题,当流动相中使用了缓冲溶液，那么泵压将会明显增加.,溶剂级别及处理方法,使用缓冲溶液 使用前必先过滤溶液. 为了避免结晶，系统中不能有残留溶液 : : 对泵的影响 破坏推杆及密封垫 : 对色谱柱的影响 导致柱塌陷 : 对流路的影响 腐蚀不锈钢流路 注意可能长菌: 特别是磷酸缓冲液 - 是细菌，菌类物质生长很好的介质. 理想

4、状态，应该每天配置新鲜的缓冲液（尤其夏天）.,溶剂级别及处理方法,溶剂过滤装置,流动相可能引出的问题,当流动相由有机溶剂换成缓冲溶液时，经常会出现沉淀等问题.,溶剂级别及处理方法,流动相的改变步骤,溶剂级别及处理方法,缓冲溶液,有机溶剂,溶剂级别及处理方法,在系统更换全部有机流动相之前，应注意以下几点, 系统应用水/有机相（1：1）比例混合，来去除曾经用过的缓冲溶液。 否则，当有机相遇到残留的缓冲液时，系统会出现结晶的现象。,流动相可能引出的问题,不同的操作者配置的流动相，可能保留时间会不同.,溶剂级别及处理方法,溶剂的预混合 对于单元系统, 分析前我们经常要预先配好混合溶剂. 例如：要配置

5、100ml 的50:50 甲醇和水的混合溶剂, 我们可以 : 1. 各称量 50ml 的水和 50ml 甲醇，再把它们混合到一起. 2. 称量50 ml 水，再用甲醇定容到 100ml容器中。 3. 称量50ml 甲醇，用水定容到100ml容器中. 所有这三种方法都将获得不同的结果。无论选用哪种，都应一直使用这种方法，以获得较好的重复性。推荐使用第一种方法。,流动相可能引出的问题,溶剂瓶的问题,1. 容器一般使用玻璃，因为塑料增塑剂有可能会导致基线不稳或是污染柱子。 当分析高灵敏度无机离子时，应避免使用玻璃容器。 2. 容器开口处应尽量小。这样可以避免由于溶剂的快速挥发导致的浓度不稳定，这样也

6、可以降低房间中的挥发物浓度。 注意不要将容器完全密封，这样会导致局部真空，泵不上液体。,溶剂瓶的问题,3. 当使用不太稳定的溶剂时, 或者每天制备新的溶剂，或者在溶剂瓶中充入惰性气体，例如氦气。 4. 不要将溶剂直接放在通风口，窗口或是门口；不要直接放在阳光下。这样会导致温度的变化，增加挥发。 通常情况下，对RI检测器影响最大，有时候也会影响到UV 检测器。 5. 一般情况下，要将溶剂瓶放置在高于溶剂传输系统（泵）的位置，这样可以保证泵有好的虹吸效果，同时避免泵空走。,溶剂瓶的问题,6.通常使用溶剂过滤器，这是一个粗滤，可以保证溶剂中的颗粒不会进入泵头。 要保证这个滤头清洁，无菌。如果脏了，可

7、以用异丙醇或是1N的硝酸超声清洗。 7. 实验室中好的习惯是在溶剂瓶上贴上标签，表明内部溶剂的名称，组成甚至制备的日期。,II. 样品可能引出的问题,进样后，系统压力都会迅速增加。,样品处理问题,1. 通常都是将样品溶解在流动相中，流动相中样品的溶解度是最好的. - 减小溶剂峰，尤其是感兴趣的样品洗脱出来离溶剂峰很近的情况。 - 保证样品在流动相中的溶解度，保证在系统，特别是柱子中不出现沉淀凝结的现象。 - 保证样品溶液与流动相之间的可混合性。 2. 通常进样前，我们用0.45um的过滤膜过滤样品。 如果预先知道样品很脏，可以在进样前用0.2um的过滤膜过滤,III. 进样可能引出的问题,手动

8、进样，重现性不好。,Rheodyne 手动进样器,1. 部分充满定量环进样方法。 - 进样量要小于定量环体积的一半。 2. 全充满定量环进样方法。 -进样量要大于定量环体积的3倍。,(Laminar flow effect),Rheodyne 手动进样器,进样体积和检测器反映值之间的关系 (峰面积),正确的进样方法 (手动),样品进样方法 : - 先插入进样针在INJECT 孔处 - 旋到 LOAD位置.上样 - 推入样品. - 旋转到INJECT位置,进样 - 移走进样针. - 清洗进样口 .,正确的进样方式 (自动进样器),1. 至少每天都要清洗流路. 2. 至少每周都要改变清洗液. 3.

9、 不可以用盐溶液作为清洗液. 4. 使用厂家推荐的自动进样瓶瓶垫. 5. 瓶垫不可以重复使用. 6. 不要把瓶子充满.,进样污染,产生交叉污染!,当样品浓度很大，检测器又在一个灵敏的使用范围时，交叉污染很容易出现。,进样器清洗,- 使用标准的针清洗接头清洗 使用后最好清洗,进样器漏液,IV. 色谱柱可能引起的问题,当我们拥有了一根新的色谱柱，我们如何检测它的初始柱效能?,检查新柱子,1. 柱效检查 柱效的检查可以在色谱柱使用前，根据厂家提供的色谱柱报告上的方法及混合样品来测定。 2. 压力检查 正常分析条件下，初始色谱柱操作压力应该记录下来，作为今后实验的参考。 3. 保护柱 应尽量使用保护柱

10、，但应注意不要给系统增加过大的压力。,操作中的注意事项.,作为新色谱柱，最好在使用前，低于分析流速下（0.2-0.3ml/min）过大约30分钟。色谱柱如果长时间没有使用，再次投入使用前，也要做相似的工作。 2. 关机时，最好逐步降低流速，不要突然降低压力，这样对色谱柱以及系统都会有影响。 3. 当使用缓冲溶液时，切记要先用水冲洗系统，再改用有机溶剂，这样可以避免结晶现象出现，堵塞柱子。,操作中的注意事项,使用前，最好过滤流动相及样品，避免颗粒物产生堵塞。 5. 样品最好溶解在流动相中，如果不是，最好也要接近流动相的组成。这样会减少样品在流动相中的不溶物沉淀在柱子中。 6. 日常使用后，可用强

11、溶剂冲洗色谱柱。例如：ODS柱每天使用完后，可用乙腈冲洗色谱柱，以除去柱子中强吸收的样品。,色谱柱的问题及解决办法,柱筛板或柱吸附了样品或溶剂的杂质形成化学结晶,或者保存包装不当,使柱子填充材料干燥, 会引起下列问题 系统压力增高,峰型不好(拖尾,前伸,分叉),保留时间改变.,色谱柱的问题及解决办法,筛板或色谱柱填料 预先要用0.45um的滤膜过滤样品和流动相，如果样品很脏的话，需要用0.25um的滤膜过滤。 尽管如此，有时候由于实验时间有限，流动相或是样品处理不彻底，还会有脏东西进入系统，造成堵塞。,色谱柱的问题及解决办法,正常情况下，用强溶剂冲洗色谱柱，可以除去这些颗粒。但有时不溶的颗粒用

12、这种方法很难除去，这时，可以考虑反冲色谱柱。 注意：这时不要连接检测器。 最终，如果冲洗不能解决问题的话，可以更换过滤筛板。但是更换时要很小心，不要破坏柱床，否则柱效会降低。不锈钢筛板是固定在色谱柱上的，所以尽量不要更换。,吸附样品 可能在系统的某部分突然堵塞. 检查方法 : 1. 检查系统堵塞的方法 (从尾到头) a. 从检测器端断开色谱柱，压力如果正常，说明检测池或从管线到检测池堵塞。 b. 如果压力仍然很高，断开色谱柱（分析柱）。（1ml/min的流速下）带保护柱的正常压力应该是不高于5kgfcm-2。如果压力正常，清洗或是更换色谱柱（分析柱）。 c. 如果压力仍然高，除去保护柱。压力正

13、常，更换保护柱。 d. 如果压力仍高，就可能使混和气或是泵的问题了。 如果管线堵了，可以使用IPA或硝酸高流速冲洗，但此时不要连接色谱柱或是检测器。,3. 基线不稳定,1. 漂移通常由于系统污染或是检测器不稳定。 2. 噪音通常由于系统污染或是系统存在气泡。 首先应检查是否系统或色谱柱脏。移去色谱柱，以两通代替，如果基线稳定，那说明色谱柱脏，按照前面提到的色谱柱清洗办法，清洗色谱柱。 如果基线仍然不稳定，如果可以的话，用IPA或1N的硝酸清洗系统，或用其他溶液，或最终流动相清洗系统。 对于一些检测器，如示差或电导检测器，如果清洗没有解决问题的话，需要检查一下柱温箱的温度。（对于RI，还要观察流动池的温度） 对于有噪音的基线，检查流动池中是否存在气泡。如果气泡存在于色谱柱中，需要长时间冲洗。 如果气泡在泵头，一般情况，也会出现压力波动，这时可以做Purge，将气泡移出。,A. 漂移B. 噪音,峰形变化 - A. 不对称 (前伸 / 拖尾),情况 1 : 方法开发 可能的原因 : 1. 不适当的溶剂选择,峰形变化 - A. 不对称 (前伸 / 拖尾),2. 二级封端的影响:由于硅胶的重金属或硅胶硅醇基残留 3. 样品过载 对于每根柱子上样量是有极限和不同的,如果超过了柱子的能力,前伸或拖尾峰就可能出现. (多数情况下拖尾). 4. 调整流动相的PH值. （特别是使用了缓冲