生物药物分析与检验氨基酸、多肽和蛋白质类药品检验.ppt

1、,第八章 氨基酸、多肽因子和蛋白质类药品检验,基本要求： 掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程。,基本内容 第一节 氨基酸类药品检验 第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验 第三节 几种氨基酸、多肽和蛋白质药物的质量分析,第一节 氨基酸类药品检验,氨基酸是治疗蛋白质代谢紊乱、蛋白质缺损所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养

2、价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效。 目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创制了一些新的生化药物。 如甲基酪氨酸治疗嗜铬细胞瘤 氧苯丙氨酸用于类癌瘤综合征 偶氮丝氨酸治疗白血病 乙酰羟脯氨酸用于治疗类风湿关节炎,第一节 氨基酸类药品检验,氨基酸为白色晶状体，熔点很高，多在熔融时分解，都能溶解在强酸强碱中，形成的盐多能溶于水。 氨基酸在等电点（pI）时溶解度最小，最稳定。 中性pI值在56.3左右。 酸性pI值在2.83.2左右。 碱性氨基酸的pI值在7.610.8左右。,第一节 氨基酸类药品检验,一、氨基酸的定性鉴别 旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、气相色

3、谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。 1、化学鉴别法 氨基酸的鉴别最常用的方法是根据所有氨基酸均能与茚三酮显蓝紫色。 采用茚三酮显色法，中国药典（2010年）二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。,1：酪氨酸 2：色氨酸 3：苯丙氨酸。,第一节 氨基酸类药品检验,这三种氨基酸可以通过紫外吸收光谱加以鉴别。 精密称取酪氨酸、色氨酸、苯丙氢酸各适量。 用水制成每1mL含20g（色氨酸）、40g（酪氨酸）、200g（苯丙氨酸）。 在波长230300nm测定各氨基酸的吸收光谱，如右图。,第一节 氨基酸类药品检验,（2）红外吸收光谱图 氨基酸在红外区都有特性图谱，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨

4、基酸的鉴别依据。 所得的吸收图谱各主要吸收峰波长和各吸收峰间的相互强度关系均应与对照的图谱一致。,第一节 氨基酸类药品检验,3、薄层色谱鉴别法 在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。 （1）薄层板的制备,第一节 氨基酸类药品检验,（2）十一种氨基酸混合液（色、蛋、亮、异亮、甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精）与对照液的制备。,第一节 氨基酸类药品检验,（3）点样、展开和显色 吸取混合液和对照液各3L，分别点于同一薄层板上。 以正丁醇-水-异丁酸-醋酸（505057）之上层作展开剂，进行单向三次展开，展开约15cm，每次必须待溶剂挥发尽后，再进行下一次展开。 喷以显色剂（吲哚醌1g，溶于1

5、00mL无水乙醇和10mL冰醋酸中）置100干燥510min至显色完全为止。,第一节 氨基酸类药品检验,本层析系统中，由于分离的程度与各种氨基酸显出不同的颜色，可以区别十一种氨基酸。 用茚三酮-硝酸钠试剂亦能显出不同颜色的色斑，且灵敏度较高。,第一节 氨基酸类药品检验,4、旋光性 除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有旋光性，且每种氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨基酸药物的鉴别指标。,第一节 氨基酸类药品检验,二、氨基酸特殊杂质及安全性检查 1、特殊杂质检查 氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸。 用薄层色谱法进行限量检查：将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液

6、稀释后作为对照液，在同一硅胶G薄板上，一般用正丁醇水冰醋酸（311）展开晾干后，喷茚三酮的丙酮溶液显色，规定供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点，以此限制其他氨基酸的含量。,第一节 氨基酸类药品检验,2、安全性检查 影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要为热原的含量。 中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。 采用家兔法，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。,第一节 氨基酸类药品检验,三、氨基酸含量测定 1、茚三酮法 茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。 当茚三酮在酸性条件下和氨基酸

7、反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成蓝紫色物，最大吸收值的波长为570nm。,茚三酮反应为一切-氨基酸所共有，反应灵敏，根据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。 本法可允许的测定范围是0.550g氨基酸。,第一节 氨基酸类药品检验,2、酸碱滴定法 谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸 赖氨酸（lysine）片中赖氨酸的测定 取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于赖氨酸0.15g）置烧杯中，加水25mL，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L），用酸度计调节至pH值为7.0，加入预先调节至pH

8、值9.0的甲醛溶液15mL，搅匀，再用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定至pH值为9.0，并持续30s。 按加入甲醛液后所耗用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）体积计算，每毫升氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于9.132mg的C6H14N2O2HCl。,第一节 氨基酸类药品检验,3、非水溶液滴定法 中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除谷氨酸用氢氧化钠为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了非水酸碱滴定法。 用冰醋酸作溶剂，高氯酸作标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。 适用于常量氨基酸的含量测定。,第一节 氨基酸类药品检验,4、定氮法 精氨酸和天冬酰胺的

9、原料及其制剂可以采用定氮法测定含量。 将被测药物置于凯式烧瓶中，加浓硫酸、硫酸盐及适量的催化剂，加热进行有机物的破坏，其中所含的氮完全转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵与强碱反应，放出氨，将其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸碱滴定法滴定，从而计算出氮的含量并换算成被测药物的含量。,第一节 氨基酸类药品检验,5、HPLC 对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前较多地采用了高效液相色谱法（HPLC）。 因大多数氨基酸没有紫外吸收，不能用紫外检测器测定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需进行化学衍生化。 衍生方式包括柱后衍生法和柱前衍生法。 柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生

10、；柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行HPLC分离。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。 多肽因子类药物指分子量不算太大的，在体内含量极微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。 其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫苗等。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,一、多肽因子类药物的定性鉴别 基因重组多肽因子类药物的鉴别主要采用SDS-PAGE法和免疫印迹法。 1、SDS-PAGE法 用SD

11、S-PAGE鉴别生物样品必须是该品有极纯的标准对照品，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标准品有相同的迁移率，从而鉴别该品。 缺点：必须有标准品；凝胶中多肽需保留生物活性，或能够复性，或电泳前可将检测配基与待测多肽共价交联。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,2、蛋白质免疫印迹电泳法（转移电泳、western blot） 原理：借助聚丙烯酰胺凝胶技术，将生物活性物质高效分离，分离后的样品可以原位、定量驱动或吸印在另一种固相载体（通常用醋酸纤维素薄膜，简称NC膜）上，能保持原有的生物活性，可以进行各种生物检测、免疫识别、扫描、积分和保存。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,（1）基本

12、操作 分3个部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳；转移电泳（即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上）；检测或鉴定薄膜上的多肽条带。 聚丙烯酰胺凝胶电泳 先将待分离样品进行凝胶电泳分离。 凝胶可用琼脂糖凝胶，也可用聚丙烯酰胺凝胶，可以是均一的，也可用梯度凝胶，凝胶缓冲体系中可含有各种变性剂，如SDS、LDS、尿素等，可进行单向或双向电泳，也可用等电聚焦电泳。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,转移电泳 将湿醋酸纤维素（NC）薄膜紧贴凝胶，凝胶与薄膜之间不能有气泡，否则在气泡所在部位的条带将不能转移，在NC膜和凝胶的另一侧放上两层湿滤纸，也不能有气泡，再在两边贴上海绵，最后用塑料网框架夹紧，插入电泳槽，

13、根据凝胶中样品所带电荷的性质，决定有NC膜的一边是靠近正极还是靠近负极一侧。 电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性质等。一般采用低电压和低电流（2mA/cm2以内）。 缓冲液中一般含有20的甲醇或乙醇，其作用主要是保持凝胶的几何形状。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,检测或鉴定 NC膜借助非共价键吸附蛋白质，经转移后蛋白质条带就固定在NC膜上，完全保留凝胶中的蛋白谱，可直接用考马斯亮蓝、氨基黑10B等染色。 如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检测，就要先用13的牛血清蛋白或血红蛋白，或非离子去垢剂（0.3吐温-20）等处理NC纸，以封闭NC纸上未吸附蛋白质区域，使其不

14、再能吸附蛋白质。 使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把NC纸上的某些蛋白质洗掉，同时还要将NC纸反复洗涤以去除变性剂，,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,二、多肽因子类药物的检查 1、分子量检查 常用还原型SDS-PAGE法检查分子量，用量约1g。 也可采用凝胶过滤法，例如Sephadecx系列（G-75，-100）；waters 160，125，250；Backman TSK 2000SW，3000SW，4000SW。 凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子量，而SDS-PAGE是测定蛋白质亚基的分子量，同时用这二种方法测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白质是否是寡聚蛋白质。,第二

15、节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,2、等电点测定 等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带电性质。 一般采用凝胶等电聚焦电泳技术测定等电点。 3、紫外吸收 不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种蛋白质或多肽来说，它的最大吸收波长是固定的。 紫外吸收光谱是检查蛋白质的一个重要指标。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,4、纯度 基因工程产品蛋白质纯度是一项重要指标，但它也是一项相对的指标，需根据实际要求而定。 蛋白质纯度一般是指是否含有其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内。 目前较常用的是HPLC法（包括凝胶过滤、各种反相HPLC、离子色谱、疏水色谱等）、非还原

16、SDS-PAGE凝胶电泳法、毛细管电泳法（CE）、等电聚焦电泳， 此外也应用一些化学方法，观察末端是否均一。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,至少应用两种以上的方法，而且是两种不同分离机理的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。 常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在离子色谱中却分辨为二个组分，反之亦然。 又如一种样品用凝胶过滤法和SDS-PAGE电泳证明是纯的，但这仍不充分，因为这两者机理相同。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,三、蛋白质类药物的鉴别和检查 1、蛋白质类药物的鉴别 蛋白质类药物可根据其各自的物理、化学性质、生理作用等采用不同的方法进行鉴别。 （1）茚三酮反应 组成蛋白

17、质的氨基酸都能与茚三酮反应生成紫色化合物，因此蛋白质也有此反应，这是蛋白质鉴别的最常用方法。 （2）福林酚反应或双缩脲反应 这两种常用来测定蛋白质的含量，但有时也用于蛋白质的鉴别。 （3）紫外吸收 由于组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外区的光吸收特性，因此可利用此种特性鉴别蛋白质。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,五、蛋白质含量测定和效价测定 1、蛋白质含量测定 蛋白质的定量可用化学方法如凯氏定氮法、双缩脲法、福林酚法、紫外光吸收法来测定；也可用染色法，如氨基黑、考马斯亮蓝测定；此外还可用荧光激发、氯胺T、放射性核素计数等灵敏度较高方法。 上述方法中凯氏定氮法、福林酚法

18、、紫外光吸收法最为常用，它们操作简单、设备便宜。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,（1）凯氏定氮法 凯氏定氮法常用来测定有机物的含氮量。 原理：A、含氮有机物的消化 当含氮有机物与硫酸共热时，分解出氮、二氧化碳、水。 氮转变出的氨与硫酸化合生成硫酸铵。 分解反应进行得很慢，可加入硫酸铜及硫酸钾或硫酸钠促进反应，其中硫酸铜为催化剂，硫酸钾或硫酸钠可提高沸点。 过氧化氢也能加速反应。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,B、铵离子的生成 消化完了以后，在凯氏定氮瓶中加入强碱（氢氧化钠溶液）消化液，使硫酸铵分解，放出氨。 用水蒸汽蒸馏法，将氨蒸入过量的硼酸溶液中，氨与溶液中的氢离子结合，生成

19、铵离子，使溶液中氢离子浓度降低。 C、测定 用强酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。 所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,（2）紫外吸收法 280nm光吸收法 由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质在275280nm波长处有一个紫外吸收高峰，在一定范围内，蛋白质溶液在280nm波长处的光吸收度值（A280）与其浓度成正比，因此可作定量测定。 该法测定范围为0.010.1mg/mL。 该法简单、灵敏、快速、不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定，因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验

20、,280nm和260nm光吸收差法 若样品中含有嘌呤、嘧啶等核酸类吸收紫外光的物质，在用来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。 由于核酸在260nm波长处的光吸收比280nm波长处更强，因此可利用280nm和260nm的吸收差来计算蛋白质浓度。 常用下列经验公式估算： 蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A2800.74A260（假设1mg/mL蛋白质溶液的A280为1.0）,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,（3）考马斯亮蓝G-250染色法 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色，可在595nm波长处进行比色测定。 该法反应快、操作简便、消耗样品少，

21、但不同蛋白质之间差异较大，且标准曲线线性较差。 测定范围为0.011.0mg/mL蛋白质。 高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有干扰，缓冲液浓度过高或改变测定液的pH也会影响显色。,第二节 多肽因子类和蛋白质类药品检验,A、溶液的配制 标准蛋白质溶液 0.1或1.0mg/mL牛血清白蛋白。 染色液 称取100mg考马斯亮蓝G-250溶解于50mL 95乙醇中，加100mL 85的磷酸，加水稀释到1000mL。该染色液可保存数月。若不加水可长期保存，临用前再稀释。 B、标准曲线 在试管中分别加标准蛋白质溶液0、6、12、24、36、48、60L，用水补足至60L，加3mL染色液，混匀后在室