10第十章 发酵过程的控制

1、第十章 发酵过程的控制,10.1 发酵过程中的代谢变化参数 10.2 温度及其控制 10.3 pH的影响及其控制 10.4 发酵过程中的代谢与控制 10.5 泡沫的影响及其控制 10.6 发酵终点的判断及不正常发酵的处理 10.7 发酵工艺的研究,发酵的一般流程,第1节 发酵过程中的代谢变化参数,1、物理参数 2、化学参数 3、生物参数,与代谢有关的参数：,1. 温度,温度对发酵的影响：,一、物理参数,酶反应速率 氧在培养液中的溶解度 菌体生长 抗生素合成,2. 压力,发酵罐维持一定程度的正压的好处：,一、物理参数,一是可以杜绝由于罐压为零时造成的染菌； 二是增加氧在培养液中的溶解度，有利于菌

2、的生长及合成抗生素。,但罐压不宜过高， 原因是二氧化碳在水中的溶解度比氧大30倍，罐压增大，二氧化碳的分压也增加。,3. 搅拌转速,提高搅拌转速可以增加氧溶解速度。,一、物理参数,4. 搅拌功率,搅拌功率与供氧系数KLa有关。,5. 空气流量,空气流量过小对发酵不利； 过大，泡沫产生过多，培养液表观体积增大，装料体积减少，缩短空气在罐内的滞留时间，浪费无菌空气。,6. 溶解氧（DO）,空气中的氧气只有溶于发酵液中才能被菌体利用； 溶氧浓度的大小与氧的传递速率及摄氧率有关。,一、物理参数,7. 表观粘度,与培养基的成分及菌体的浓度有关。,1. 基质浓度,发酵过程中糖、氮、磷等营养物质的含量是反映

3、产生菌代谢变化的重要参数。,二、化学参数,必须经常测定糖、氮等基质的浓度。,2. pH,发酵液的pH是发酵过程中各种生化反应的酸碱性的综合反映。,二、化学参数,酶的活性与基质的pH有关，不同的菌所含的酶类不同，其合适pH就不同。,3. 脱氧核糖核酸（DNA）,DNA 是细胞生长的基本物质。,二、化学参数,以DNA为参数可以清楚地区分发酵的各个阶段。,1. 菌丝形态,菌丝形态的改变是代谢变化的反映。,三、生物参数,以抗生素生产说明： 以菌丝形态作为衡量种子质量、区分不同的发酵阶段、控制发酵过程的代谢变化及决定发酵周期的依据之一。,2. 菌体干重（或菌体浓度）,生物量,三、生物参数,与补料、供氧工

4、艺、抗生素产量等都有关系。,3. 菌体比生长速率,每小时单位质量的菌体所增加的菌体量称为菌体比生长速率，h-1。,三、生物参数,需将菌体比生长速率控制在一定范围内，以便使抗生素的生产速率维持在较高的水平。,它是发酵动力学中的一个重要参数。,4. 氧比消耗速率,又称呼吸强度（QO2） 每小时单位质量的菌体所消耗的氧的数量。,三、生物参数,5. 糖比消耗速率,每小时单位质量的菌体所消耗的糖量。,三、生物参数,6. 氮比消耗速率,每小时单位质量的菌体所消耗的氮的数量。,第2节 温度及其控制,生产菌在最适温度范围以下培养时，生长代谢慢；反之则生长代谢加快。,微生物生化反应与温度有着密切的关系。,1、温

5、度对发酵的影响,对细胞生长的影响：温度升高，从酶反应动力学来看，生长代谢加快，但由于酶很容易热失活，所以高温时菌体易于衰老； 对产物形成的影响：菌体生长速率、呼吸强度和代谢产物形成速率的最适温度往往是不同的；温度升高，一般产物生成提前； 对生物合成的方向的影响：反馈抑制随温度变化而改变； 对发酵液物理性质及溶解氧的影响：影响氧的溶解和传递，影响一些基质的分解，间接影响生物合成。,2、发酵热的产生（p207）,发酵热：发酵过程释放出来的净热量。 包括： 生物热：微生物生长繁殖过程中的产热 搅拌热：机械搅拌造成的摩擦热 蒸发热：被通气和蒸发水分带走的热量 辐射热：发酵罐罐体向外辐射的热量 显 热：

6、空气流动过程夹带着的热量 Q发酵= Q生物+ Q搅拌- Q蒸发- Q显-Q辐射,3、发酵热的测定,通过冷却水进出口温度和流量测定： Q发酵=Gcw(t1-t2)/V G冷却水流量； Cw水的比热； V发酵液体积。 通过发酵液温度随时间上升的速率测定： Q发酵=(M1c1+ M2c2)S M1、c1 发酵液质量、比热； M2、c2 发酵罐质量、比热； S温度上升速率。,发酵热在发酵过程中随时间变化。 为使发酵在一定温度下进行， 措施有： 在罐夹层（即夹套）或盘管（即蛇管）内通入冷却水或冰盐水来调节； 在发酵前期或种子罐是通热水保温。,4、最适温度选择与发酵温度控制,温度变化的一般规律与控制的一般

7、原则 接种后发酵温度有下降趋势，此时可适当升高温度，以利于孢子萌发和菌体的生长繁殖； 待发酵液温度开始上升后，应保持在菌体的最适生长温度； 到主发酵旺盛阶段，温度应控制在比最适生长温度低些，即代谢产物合成的最适温度； 到发酵后期，温度下降，此时适当升温可提高产量。 选择是相对的，要考虑培养基成分、浓度；溶氧（温升氧降）；生长阶段；培养条件等。,4、最适温度选择与发酵温度控制最适温度选择,最适温度分最适生长温度和最适产物合成温度，两者往往不同，各阶段可用不同温度。 如：青霉素分别为： 30和 24.7 。 青霉素发酵的温度控制 0-5h：30C 6-35h：25C 36-85h：20C 86-1

8、25h：25C,4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制,进行温度控制时应考虑的因素： 不同菌种在不同生长阶段的生长和生产特性 参考其它发酵条件（通气、培养基成分和浓度、pH值等）。如通气条件差时，则最适发酵温度比通气良好时低。,4、最适温度选择与发酵温度控制发酵温度控制,温度控制的方法： 冷却是主要的方法，通常是利用发酵罐的热交换装置进行降温，如果气温较高，冷却水温度也较高时，多采用冷媒(盐水)进行降温。 发酵罐的热交换装置： 罐外夹套 罐内蛇管、列管,第3节 pH的影响及其控制,1、 pH对发酵的影响 2、影响发酵pH的因素 3、最适pH的选择和调节,pH是决定产生菌各种酶活性的重要因素

9、。,确定和有效控制pH在菌体生长或产物 积累的最适范围是高产的保证。,1、 pH对发酵的影响,微生物生长最适pH值范围 不同的微生物具有不同的最适生长的pH值。 细菌6.5-7.5； 放线菌6.5-8.0； 霉菌4.0-5.8； 酵母菌3.8-6.0 产物形成最适pH值范围 微生物的生长和产物形成的最适pH值往往不同。 少数一致，大多不同； 有的偏高，有的偏低。,1）影响微生物的生长繁殖。 石油吃蜡酵母（解脂假丝酵母和热带假丝酵母）在 pH 3.5-5.0 范围内生长良好且不易染菌；高于5时，形态变小，发酵液变黑，发酵过程中容易被细菌污染；pH低于3时，生长受到严重的抑制，细胞极不齐整，且出现

10、细胞自溶的情况。,2）影响微生物的形态。 产黄青霉细胞壁的厚度会随pH的增加而减小。 pH低于6时，菌丝长度变短，直径为2-3m； pH 大于7时，菌丝直径为2-8 m ，膨胀菌丝增多； pH下降后，菌丝又恢复到正常状态。,3）pH影响代谢产物形成的数量和代谢途径方向 pH不同，往往引起菌体代谢过程不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。 如黑曲霉:在pH 2-3时发酵产生柠檬酸， 在pH近中性时，则产生草酸。 谷氨酸发酵:在中性和微碱性条件下积累谷氨酸，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺。 酵母在酸性条件下产生乙醇，而在碱性条件下发酵产物是甘油。,4）影响产物的稳定性 如噻纳霉素

11、的发酵中， pH值在6.7-7.5之间时，抗生素的产量相近，产品稳定性未受影响，半衰期也无变化； 但当pH大于7.5时，抗生素半衰期缩短，稳定性下降，发酵产量也减少。,5）pH在微生物培养的不同阶段有不同的影响,生长,合成,pH对菌体生长影响比产物合成影响小,X,pH,四环素,放线菌金色链丛菌,（1）pH影响酶的活性。当pH值抑制菌体某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻；,（2）pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的透性，影响微生物对营养物质的吸收及代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行；,（3）pH值影响培养基某些营养成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用。,pH值

12、影响微生物生长繁殖和代谢的原因,2、影响发酵pH的因素,影响pH值的因素：培养基成份、微生物代谢特性决定发酵过程的pH变化。（综合反映） 微生物改变培养液pH以适合自身生长的能力很强。 发酵液的实际pH是“成分”和“途径”的统一。 此外，通气状况的变化，菌体自溶和杂菌污染都可能引起发酵液pH的变化。,1.基质代谢,糖代谢 特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一。 氮代谢 当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。 生理酸碱性物质 被微生物利用后会导致环境pH下降

13、（上升）的物质称为生理酸性（碱性）物质。,生理碱性物质：经微生物代谢后，导致pH上升（碱性物质生成或酸性物质消耗）的物质。 如：有机氮源，硝酸盐，有机酸 （产NH3、NaOH） 生理酸性物质：经微生物代谢后，导致pH下降（酸性物质生成或碱性物质消耗）的物质。 如：糖类（产有机酸），脂肪（产脂肪酸），铵盐 （氧化产硫酸）。,2.产物形成,某些产物本身呈酸性或碱性，使发酵液pH变化。如有机酸类产生使pH下降，红霉素、洁霉素、螺旋霉素等抗生素呈碱性，使pH上升。,3.菌体自溶 发酵后期，pH上升。可做为终止发酵的指示。,3、最适pH的选择和调节,最适pH的选择和调节的原则： 既有利于菌体的生长繁殖，

14、又可最大限度的获得高产。 根据不同微生物的特性，在发酵过程中随时检查pH 值的变化，选用适当的方法进行调节。,最适pH值是根据实验结果来确定的。,3、最适pH的选择和调节,生长最适pH和产物形成最适pH的相互关系： 两者相同，范围都宽；容易控制。 两者相同，范围都窄；必须严格控制。 两者相同，范围一宽一窄；必须严格控制。 两者不同，范围都窄；分别严格控制。,实际生产中，从以下几个方面进行： （1）选择适当的培养基成分和配比： 适当调整C/N比，使盐类与碳源配比平衡。 一般情况：C/N高时（真菌培养基），pH降低； C/N低时（一般细菌），经过发酵后，pH上升。 有些成分可在中间补料时补充调控。

15、,pH的控制,在发酵过程中，发酵液的pH随着微生物活动而不断变化，为提供菌体适宜的生长或产物积累的pH值，需要对发酵生产过程各阶段的pH值实施监控。,（2）加适量缓冲剂 如碳酸钙、磷酸盐等 添加CaCO3最普遍 价格便宜、使用方便、效果好。 当用NH4+盐作为氮源时，可在培养基中加入CaCO3，用于中和NH4+被吸收后剩余的酸。 磷酸盐在生产上使用较少 价格高 磷酸浓度增高对发酵有影响,（3）直接加入酸或碱类物质 如盐酸、氢氧化钠、氨水等 加盐酸、氢氧化钠等强酸碱效果明显，能使pH迅速恢复正常；但同时会增加Cl-1、Na+的浓度。 改用氨水、尿素、乙酸等弱有机物。,氨水流加法：氨水可以中和发酵

16、中产生的酸，且NH4+可作为氮源，供给菌体营养。 通氨一般是使压缩氨气或工业用氨水(浓度20左右)，采用少量间歇添加或连续自动流加，可避免一次加入过多造成局部偏碱。氨极易和铜反应产生毒性物质，对发酵产生影响，故需避免使用铜制的通氨设备。,氨基酸发酵常用此法； 这种方法既可以达到稳定pH值的目的，又可以不断补充营养物质，特别是能产生阻遏作用的物质。少量多次补加还可解除对产物合成的阻遏作用，提高产物产量。 也就是说，采用补料的方法，可以同时实现补充营养、延长发酵周期、调节pH值和培养液的特性(如菌浓等)等几个目的。,应急措施： 改变搅拌转速或通气量，以改变溶解氧浓度，控制有机酸的积累量及其代谢速度

17、； 改变温度，以控制微生物代谢速度； 改变罐压及通气量，降低CO2的溶解量； 改变加油或加糖量等，调节有机酸的积累量；,第4节 发酵过程中的代谢与控制,随时掌握发酵液的代谢变化情况，并加以控制，使发酵过程最优化，需要进行中间分析。,发酵过程中在一系列酶的催化作用下， 培养基基质不断消耗，菌体不断积累， 产物浓度不断增加。,1.分析项目,抗生素效价 pH 糖含量 氨基氮和氨氮 磷 菌丝浓度和黏度,培养基基质既有浓度限定，又需要合适的配比； 在搅拌功率不太大的情况下，培养基基质的总浓度不宜过高，以能满足菌体在一定时间内生长代谢需要为原则； 中间浓度低时，可通过补料予以补充，使培养基维持在一个适当的

18、浓度； 通过补料，推迟菌的自溶期，延长菌的生产期，提高了发酵单位，使产量大幅上升。,2.发酵基质浓度与中间补料,1）补充碳源和能源物质,补料内容,如葡萄糖、糊精、液化淀粉等,2）补充氮源物质,分无机和有机氮源,3）补充无机盐、微量元素前体和促进剂,1）补糖,补料控制,间歇或连续定速流加，使罐内糖浓度不超出限定范围,过早：菌丝生长太快，增加糖的消耗，干扰代谢平衡。,浓度过高：影响呼吸作用。,过迟：菌体生长不良。,2）通氨及补氮,补料控制,通氨是许多发酵代谢控制的重要项目。,调节pH,补充无机氮源,通过空气分布管通入，借搅拌作用与发酵液迅速混合，并减少大量泡沫的产生。,补料中应注意的问题 选择合适

19、的补料的时机、方式和控制指标 料液的配比要恰当（如C/N等） 注意对培养基性质的改变（如pH值等） 加强无菌控制 经济、节约,第5节 发酵过程中溶解氧的控制,由于依赖获得能量的代谢方面的差异，微生物对氧的需要也存在不同。好气菌主要是有氧呼吸，厌气菌为厌气发酵，兼性厌气菌则两者兼而有之。 不同微生物或同一微生物的不同生长阶段对通风量的要求也不相同。 呼吸商（Respiratory quotient, RQ）,影响微生物摄氧率的因素,菌种； 细胞浓度； 培养基成分和浓度： 如：碳源，利用速度不同摄氧率不同； pH； 温度：温度高，临界值增高； 有毒物积累，抑制呼吸； 挥发性中间物（有机酸），加强；

20、 溶解氧浓度。,r= QO2.X,提高溶氧的方法,减小培养基粘度； 合适的细胞浓度、碳源种类、pH、温度；调节微生物呼吸强度的临界值； 加强搅拌； 适当的空气流量； 提高氧分压。,通风和搅拌,通气量与菌种、培养基性质、培养阶段有关。 通气量的多少，最好按溶解氧的多少来决定。只有氧溶解的速度大于菌体的吸氧量时，菌体才能正常地生长、繁殖。因此随着菌体繁殖，呼吸增强，必须按菌体的吸氧量加大通气量，以增加溶解氧的量。,通风和搅拌,搅拌则能使氧气更好地与培养液混合，保证氧的最大限度溶解; 搅拌有利于热交换，使培养液的温度一致; 还有利于营养物质和代谢物的分散; 此外，挡板则有助于搅拌，使其效果更好。,通

21、风和搅拌,一般来说，若发酵罐深，搅拌转速大，通气管开孔小，气泡在培养液内停留时间就长，氧的溶解速度就大，而且在这些因素确定的情况下，培养基的粘度越小，氧的溶解速度也越大。 搅拌可以提高通气效果，但是过度地剧烈搅拌会导致培养液大量涌泡，容易增加杂菌污染的机会，微生物细胞也不宜剧烈搅拌。,第6节 泡沫对发酵的影响及控制,泡沫产生的原因 泡沫过多对发酵的危害 泡沫的消长规律 泡沫的消除和防止,1、泡沫产生的原因,通气产生泡沫 微生物代谢气体形成泡沫 泡沫的产生与培养基性质有关 （蛋白质原料、蜜糖水解原料，淀粉水解不完全时易发泡）,2、泡沫过多对发酵的危害,使装量减少，或造成逃液，使产量降低； 通过轴

22、封泄漏，污染设备，增加染菌机会； 菌体粘附罐顶、罐壁，发酵液中菌体量减少； 影响通气搅拌的进行，造成减产或菌体提前自溶； 菌体提前自溶会促使更多泡沫形成，恶性循环； 加消泡剂，给提取工艺带来困难。,3、泡沫的消长规律,通气和搅拌： 随通气和搅拌增加而增加，搅拌比通气影响大； 培养基原料性质： 蛋白胨、玉米浆、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉等蛋白质原料是主要发泡物质； 培养基灭菌方法： 温度过高，形成蛋白黑色素，5羟甲基糖醛，泡沫增多； 细胞代谢活动： 初期，高粘度、低张力，泡多；中期，粘度降、张力升，泡少；后期，自溶，泡上升。,4、泡沫的消除和防止,消泡方法： 改变培养基成份，减少通气，选育新生产

23、种 机械法：靠机械强烈振动，压力的变化，使 气泡破裂，或借助机械力将排出气 体中的液体加以分离回收 化学法：添加消泡剂（油类等），应用面广,4、泡沫的消除和防止,机械消泡 优点：节省原料、减少了染菌机会 缺点：不如化学消泡迅速可靠，不能从根本上消除引起气泡的原因，需设备，耗能。 机械消泡装置的选择依据：动力小、结构简单、坚固耐用、清洁（杀菌）容易、维修（保养）费用少,4、泡沫的消除和防止,机械消泡方法 罐内消泡：在发酵罐内消除泡沫 耙式消泡桨、碟式消泡器等 罐外消泡：将泡沫引出发酵罐外，消泡后再 返回罐内 旋转叶片消泡器、离心式消泡器等,4、泡沫的消除和防止,耙式消泡桨,4、泡沫的消除和防止,碟片式消泡器 优点：消泡能力强，功耗小缺点：结构复杂，维护麻烦,4、泡沫的消除和防止,旋转叶片罐外消泡,4、泡沫的消除和防止,离心力罐外消泡,4、泡沫的消除和防止,化学法：发酵工业常用