高中生物教学里的现代生物技术及DNA复制

1、,1.胞内DNA复制,1.条件 (1)模板 (2)原料4种dNTPs （dATP ,dGTP,dCTP,dTTP） (3)酶解旋酶，DNA聚合酶，引物合成酶， DNA连接酶等 (4)能量高能磷酸键水解 （dATP dAMP） (5)引物RNA,2.过程：引发复制原点，延伸dNTP连接至 3-OH端，终止整条链复制结束 3.特点：半保留复制、半不连续复制,4.真核细胞DNA的多起点复制（每个细胞周期只起始一次）,例：下图为真核生物染色体上DNA分子复制过程示意图，有关叙述错误的是 A图中DNA分子复制是从多个起点同时开始的 B图中DNA分子复制是边解旋边双向复制的 C真核生物DNA分子复制过程需

2、要解旋酶 D真核生物的这种复制方式提高了复制速率,5.原核细胞的单起点复制,2.PCR技术,1.条件： 模板 酶Taq酶 原料4种dNTPs 能量 引物两段与待扩增DNA序列互补的单链 DNA，人工合成,2.过程 高温变性、低温退火、室温延伸,3.检测琼脂糖凝胶电泳 电泳：带电荷的供试品（蛋白质、核酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等），在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分含量的方法。,实验原理：DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。 DNA分子在琼

3、脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应和分子筛效应。不同DNA的分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。,制胶,电泳、成像,结果,例：下图甲中4号为X病患者，对1、2、3、4进行关于X病的基因检测，将各自含有X病基因或正常基因的相关DNA片段（数字代表长度）用层析法分离，结果如下图乙。下列有关分析判断正确的是,3.基因探针,基因探针，即核酸探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，与目的基因或DNA互补的核酸序列(DNA或RNA)。通过分子杂交与目的基因结合，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来 。,分子杂交技术的分类,根据其检测对象不同，可分为,基本操作程序,Southern杂交

4、,检测样品DNA的处理,电泳分离及变性处理,转移并固定到滤膜上,探针的制备及杂交,检测与分析,样品DNA的处理,提取检测样品的基因组DNA 用限制性内切酶对其进行酶切，至大小不同的DNA片段,电泳分离及变性处理,琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段,变性处理 通常DNA变性的方法：热变性、酸碱变性、化学试剂变性 在0.4M NaOH碱性条件下变性,凝胶,0.4M NaOH,转移并固定到滤膜上,通过毛细管虹吸法，将凝胶上的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。最后通过紫外线照射将DNA固定在滤膜上。,探针的制备,一、探针的合成 PCR、化学合成等方法 二、探针的标记 同位素：3H、35S、32P等 非同位

5、素：地高辛、生物素、荧光素等,杂交,杂交：在一定的温度和溶液条件下，将标记的探针与滤膜混合，如果滤膜上的DNA分子存在与探针同源的序列，那么探针将与该分子形成杂合双链，从而吸在滤膜上。,洗膜：经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除去。,检测与分析,1、放射自显影：适用于放射性同位素标记的探针 2、比色或化学发光检测：适于非同位素标记的探针 通过放射自显影或生化检测，就可判断滤膜上是否存在与探针同源的DNA分子及其分子量。,4.同位素标记和荧光标记,同位素标记法,同位素：具有相同质子数，不同中子数的同一元素，互称同位素，即质量不同而化学性质相同的原子。 同位素示踪法：用示踪元素标记的化合物， 可以

6、根据这种化合物的放射性，对有关的一系列化学反应进行追踪。这种科学研究方法叫做同位素示踪法，也叫同位素标记法。,用途：可用于研究细胞内的元素或化合物的来源、组成、分布和去向等，进而了解细胞的结构和功能、化学物质的变化、反应机理。 还可用于疾病的诊断和治疗，如碘的放射性同位素可以用来治疗甲状腺肿大。 一次只能使用一种同位素标记,教材中应用到同位素示踪法的地方 必修1经典实验“分泌蛋白的合成和分泌”（ 3H标记亮氨酸）。 必修1课外读“光合作用早期研究简史”（ 14C标记CO2）。 必修2经典实验“噬菌体侵染细菌的实验”（35S和32P分别标记噬菌体外壳和DNA）。 必修2“探究DNA的复制过程”（15N标记NH4Cl）。 选修3DNA分子杂交技术：用放射性同位素32P标记的探针进行目的基因的检测。,荧光标记法,荧光标记法（Fluorescent Labeling）：利用荧光蛋白或荧光蛋白基因作为标志物对研究对象进行标记的分析方法。常用的荧光蛋白为绿色和红色两种。 优势：可以在同一试验中，分别或同时使用两种不同的荧光蛋白分别或同时研究。,教