浙江大学生物化学实验甲蛋白质的沉淀和变性反应.ppt

1、蛋白质的沉淀和变性反应,1.1、原理 蛋白质分子在水溶液中，由于其表面形成了水化层和双电层而成为稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液为一种亲水胶体溶液。 当蛋白质溶液在一定物理化学因素的影响下，蛋白质胶体颗粒的稳定条件被破坏，如失去电荷、脱水，甚至变性，则蛋白质分子将以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应。 根据其特点的不同可分为可逆沉淀反应和不可逆沉淀反应两种类型。,蛋白质的沉淀和变性反应,1、可逆沉淀反应 蛋白质虽已沉淀析出，但其分子内部结构并未发生显著变化，如果把引起沉淀的因素去除后，沉淀的蛋白质能重新溶于原来的溶剂中，并保持其原有的天然结构和性质。 如蛋白质的盐析作用和等电点沉

2、淀作用 及在低温下，乙醇、丙酮短时间内对蛋白质的沉淀作用。,蛋白质的沉淀和变性反应,蛋白质盐析作用的原理 用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。 蛋白质是亲水胶体，蛋白质溶液在高浓度中性盐的影响下，蛋白质分子被中性盐脱去水化层，同时所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。 析出的蛋白质仍保持其天然性质，当降低盐的浓度时，还能溶解，即蛋白质的盐析作用是可逆过程。,蛋白质的沉淀和变性反应,沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同； 沉淀相同的蛋白质，因所用中性盐的不同所需的盐浓度也不同。 所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀

3、析出，该法称为蛋白质的分级盐析，在提纯蛋白质时常被应用。 2、不可逆沉淀反应,蛋白质的沉淀和变性反应,蛋白质分子发生沉淀时，其分子内部空间结构遭到破坏，蛋白质分子由规则性的结构变为无秩序的伸展肽链，使原来的天然性质丧失，即蛋白质已发生了变性，这种由于蛋白质变性而产生的沉淀不能再溶解于原来的溶剂中。 如重金属盐、植物碱试剂、强酸、强碱、有机溶剂等化学因素引起的蛋白质沉淀作用，以及加热、振荡、超声波、紫外线、X-射线等物理因素所引起的蛋白质沉淀作用。,蛋白质的沉淀和变性反应,天然蛋白质变性后，变性的蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠绕在一起形成紧密的固体团块的现象称为蛋白质的凝固。 几乎所有的蛋白质都

4、会因加热变性而凝固，变成不可逆的不溶状态。 、重金属盐沉淀蛋白质的原理,蛋白质的沉淀和变性反应,蛋白质在水溶液中为酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质的等电点而言），蛋白质分子带负电荷，可与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐，当加入汞、铅、铜、银等重金属的盐时，蛋白质则形成不溶性的盐类而沉淀析出，这种沉淀不再溶解于水中，说明它已发生了变性。 应注意，当用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可使沉淀出的蛋白质重新溶解。,蛋白质的沉淀和变性反应,、无机酸沉淀蛋白质 浓的无机酸（除磷酸外）都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。但过量的无机酸（硝酸除外）可

5、使沉淀出的蛋白质重新溶解。 、有机酸沉淀蛋白质 在酸性溶液中（对蛋白质的等电点而言），蛋白质分子带正电荷，可与带负电荷的酸根结合，生成不容性的蛋白质盐复合物而沉淀。,蛋白质的沉淀和变性反应,三氯乙酸和磺基水杨酸是沉淀蛋白质最有效的两种有机酸。 、有机溶剂沉淀蛋白质 乙醇、丙酮都是脱水剂，能破坏蛋白质胶体颗粒的水化层，而使蛋白质沉淀。 低温时，用乙醇（或丙酮）短时间对蛋白质作用，蛋白质虽沉淀但仍保持其原有的生物活性，如将乙醇或丙酮除去后，沉淀仍可溶解。 但如用乙醇进行较长时间的脱水则可使蛋白质变性沉淀。,蛋白质的沉淀和变性反应,、加热沉淀蛋白质 蛋白质可因加热变性沉淀而凝固，盐浓度和氢离子浓度对蛋白质加热凝固有重要影响。 少量盐类能促进蛋白质的加热凝固； 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全、最迅速； 在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正电荷或负电荷，虽加热蛋白质也不会凝固； 但如同时有足量的中性盐存在，则蛋白质可因加热而凝固。,蛋白质的沉淀和变性反应,1.2、材料与试剂 1、实验材