安农大 微生物工程 复习

1、第三代微生物发酵技术微生物工程：是以微生物为主体，应用生物科学，特别是微生物学的理论和方法，结合现代工程技术手段，利用微生物的某种特定性状和功能，按照人们设计的蓝图，改良、加工、繁殖微生物，以获取微生物体本身或其代谢产物等有用物质，为人类生产、生活为目的的一门新兴学科。微生物工程的应用：1.微生物工程在食品工业中的应用：包括传统的含醇饮料、调味品、乳制品等，至今其产量和产值还占生物技术的首位。含醇饮料：葡萄酒、果酒、黄酒、白酒、啤酒、白兰地、威士忌、伏特加等。传统调味品及发酵食品：酱、酱油、醋、豆鼓、豆腐乳、饴糖、泡菜等。发酵乳制品：奶酒、干酪、酸奶等；2.微生物工程在医药卫生中的应用：抗生素

2、、氨基酸、维生素、甾体激素、生物制品、治疗用酶、酶抑制剂。半合成抗生素：某些天然抗生素在去侧链后，可用化学合成法接上新的侧链而改变原有抗菌谱或其它特性，这样的抗生素就被称为半合成抗生素。常用的半合成抗生素：青霉素型和头孢菌素型。常用的半合成青霉素：甲氧苯青霉素（新青）、乙氧萘青霉素（新青）、苯唑青霉素（新青）、氨苄青霉素、羟氨苄青霉索等。3.微生物工程在轻工业中的应用：主要是用于轻工业及其食品工业中的酶：糖酶、蛋白酶、果胶酶、脂肪酶、凝乳酶、过氧化氢酶。4.微生物工程在化工能源产品中的应用：利用发酵、生物转化或酶法生产下列产品：烷烃、醇及溶剂、有机酸、多糖、清洁能源。5.微生物工程在农业中的应

3、用：生物农药、生物除草剂、生物增产剂、食用菌和药用真菌。6.微生物工程在环境保护中的应用：厌气发酵法、好气发酵法。7.微生物工程在细菌冶金中的应用：8.微生物工程在高技术研究中的应用：如基因工程中用的限制性内切酶、连结酶、DNA探针等；生物芯片(blochip）等。第二代微生物发酵技术深层培养技术（deep culture）、沉没培养法、液体培养法。在深层的液体培养中进行的一种发酵培养方法。操作时将无菌空气通入容器中，不断搅拌，使微生物充分与氧气接触而迅速繁殖。占地面积小，劳动力省，产量高，适合于机械化和自动化生产。适用于需氧性微生物。微生物工程的工业生产三个要素：生产菌种的性能、发酵及提纯工

4、艺条件、生产设备。其中优良的菌种是最重要的。一般菌种分离纯化和筛选步骤如下：标本采集标本材料的预处理富集培养菌种初筛菌种复筛性能鉴定菌种保藏。标本的预处理方法：（1）采用热处理方法减少材料中的细菌数 ：放线菌的繁殖体、孢子和菌丝片段。（2）采用膜过滤和离心的方法浓缩水中的细胞。（3）采用化学方法。（4）诱饵法：将固体基质等加到待检的土壤或水中，待其菌落长出后再铺平板分离。（5）空气搅拌法 ：在空气中搅拌，收集孢子沉淀，如稻草的处理。菌种的分离：（1）施加选择性压力分离法：利用不同种类的微生物对环境和营养要求的不同，人为控制这些条件，使之利于某类或某种微生物的生长，而不利于其他种类微生物的生存，

5、以达到使目的菌种占优势，而得以快速分离纯化的目的。分离培养基的效率取决于其养分，pH和加入的选择性抑制剂等。培养方法：液体培养方法和固体培养方法。固体培养方法：固体培养基常用于分离某些酶产生菌，其选择培养基中常含有所需酶的基质，以便促进酶产生菌的生长。液体培养方法：摇瓶培养（分批式富集培养），连续培养（恒化式富集培养）。（2） 随机分离方法：抗生素产生菌的分离、抗肿瘤药物产生菌的分离、酶抑制剂产生菌的分离、生长因子产生菌的分离、多糖产生菌的分离。菌种选育方法：自然选育+人工选育：诱变、杂交、原生质体融合、基因工程。自然选育的优点：简单易行，并可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量的

6、目的。 缺点：效率低、进展慢。诱变育种的基本过程：选择合适的出发菌株制备待处理的菌悬液诱变处理筛选保藏和扩大试验。出发菌株应具备：（1）对诱变剂的敏感性高；（2）具有特定生产性状的能力或潜力。出发菌株的来源：（1）自然界直接分离到的野生型菌株；（2）历经生产考验的菌株；（3）已经历多次育种处理的菌株。制备细胞悬液：要求：（1）菌体处于对数生长期，并使细胞处于同步生长； （2）细胞分散且为单细胞，以避免表型迟延现象（phenotypic lag）；诱变剂的作用：（1）提高突变的频率；（2）扩大产量变异的幅度；（3）使产量变异朝着正突变或负突变移动。杂交育种指将两个基因型不同的菌株经吻合或接合，使

7、遗传物质重新组合，从中分离和筛选具有新性状的菌株。1.细菌杂交：细菌的杂交可以通过细菌接合、F因子转导、R因子转移、转化和转导等发生基因重组。普遍性转导，双交换形成转导子。2.放线菌的杂交育种：（1）放线菌的杂交原理：包括四种遗传体系：a.异核现象：所谓异核体即同一条菌丝或细胞中含有不同基因型的细胞核。b.接合现象：菌丝间接触和融合后，相同细胞质里不同基因型的细胞核在双方增殖过程中，发生部分染色体的转移或遗传信息的交换。接合现象的结果导致部分合子的形成。部分合子是由一个供体染色体片段与一个受体染色体的整体相结合而形成的，但亦可能两个亲本染色体都不完整。c.异核系的形成：当部分合子形成后，接着就

8、产生杂合的无性繁殖系（异核系Heterroclone）的细胞核，即经过一次单交换而产生的异核系染色体组。它有一个二体区，根据交换数目和染色体间的关系而产生单倍重组体或重组异核系。异核系的菌落形态很小，遗传类型各不相同。能在基本培养基上或选择性培养基上生长。但将异核系的分生孢子影印到同样培养基上就不能生长。d.重组体的形成：异核系不稳定，在菌落生长过程中，染色体重叠两节段(二体区)的不同位置上发生交换后，能产生重组体孢子。异核系所产生的孢子几乎全部是单倍体，而成为一个单倍的无性繁殖系，能长出各种类型的分离子。（2）放线菌的杂交方法：常用的放线菌杂交方法主要有三种，即混合培养法、平板杂交法、玻璃纸

9、转移法。具体步骤为：（1）玻璃纸混合培养；（2）混合培养物的转移；（3）异核系的分离。3.霉菌的杂交育种：（1）准性生殖的过程：是指真菌中不通过有性生殖的基因重组过程。准性生殖的整个过程包括三个相互联系的阶段，即异核体的形成，二倍体的形成，体细胞重组。（2）霉菌的杂交技术：选择直接亲本：具有遗传标记。异核体的形成：混菌培养。双倍体的检出：斑点和扇面。分离子的检出：纯化、鉴别。原生质体融合的优越性：（1）有利于不同种属微生物的杂交。（2）重组频率高于其他杂交方法。（3）遗传物质传递更加充分、完善，既有核配，又有质配。（4）可以用温度、药物、紫外线等处理、纯化亲株的一方或双方，然后使之融合再在再生

10、菌落中筛选重组子，提高筛选效率。（5）用微生物的原生质体进行诱变，可明显提高诱变频率。 原生质体融合方法：（1）原生质体制备：方法：主要是酶法，如溶菌酶、纤维素酶等。原生质体制备后，由于原生质体对渗透压敏感，所以必须使它处于高渗环境中以维持其稳定性，否则就会在低渗条件下破裂失活。 （2）原生质体融合：原生质体的融合有自然融合与人工融合之分；前者虽然发生融合，但其融合率极低。因此，往往以化学融合剂或电场诱导法进行人工融合，以提高其融合率。目前最为常用的方法是将二亲本菌株的原生质体混合在一起，以PEG助融。（3）原生质体再生：再生即是使原生质体再生成细胞，这样才可以对它的子代进行遗传鉴别。（4）融

11、合子的检出：原生质体融合后，是否形成融合重组菌株，一般可用下列方法进行检测：直接法：将融合液涂布在不补充两亲株生长所需的营养物质，或者补充有二种药物的再生平板上，直接筛选出原养型的成双重抗药性的重组菌株；或者利用荧光染色法，直接在荧光显微镜下观察挑取。间接法：即将融合液涂布在丰富营养的再生平板上，使未融合的亲本菌株和已融合的重组菌株都能再生，然后用影印接种法，接种在选择培养基上以检出重组菌株，进一步选出高产菌株。质粒不稳定可分为分裂不稳定和结构不稳定两种情况。质粒的分裂不稳定：是指基因工程菌分裂时，出现一定比例不含质粒的子代菌。质粒的结构不稳定：是指外源基因从质粒上丢失、碱基重排或缺失，引起基

12、因工程菌性能的改变。质粒不稳定产生的原因：一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率；二是这两种菌的比生长速率()差异的大小。提高质粒稳定性的方法：（1）两阶段培养法；（2）控制适当的培养条件。菌种经过长期人工培养或保藏，由于自发突变的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象称为菌种衰退。菌种衰退的原因是有关基因的负突变。所谓负突变是指生产菌株的生产性状下降的突变，主要表现为：在形态上：分生孢子减少或颜色改变。在生理上：常指产量的下降. 防止菌种衰退的方法有：（1）控制传代次数；（2）选择合适的培养条件；（3）利用不同类型的细胞进行传代；（4）选择合适的保藏方法。菌种保藏的原理和方法：菌种保藏主要是根

13、据微生物的生理、生化特性，在人工创造的条件下使其代谢处于不活泼的休眠状态，生长繁殖受到抑制。这样就能尽可能地减低菌种的变异率。那么，要创造适于微生物休眠的环境，主要是通过降低培养基营养成分（寡营养）、低温、干燥和缺氧四个手段。（1）斜面低温保藏法：将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种充分生长后，便可放在4左右的冰箱中进行保藏。细菌、酵母菌、放线菌和霉菌都可使用这种保藏方法。保存期为3-6个月。原理：低温下，微生物代谢强度明显下降。这种保藏方法的弊端：短期内多次传代；容易引起菌种发生变异，杂菌污染的机会随之增多。（2）砂土管保藏法：适合于产孢子或芽胞的微生物。一般保存期为2年左右，有的可达

14、十至几十年。原理：干燥，寡营养。（3）真空冷冻干燥保藏法：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物，便于大量保藏，菌种存活时间长，是目前最好的保藏方法。原理：干燥，低温。（4）液氮保藏法：将菌种置于保护剂中，预冻后保存在液氮超低温冰箱中（-196）。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。对一些不产孢子的菌丝体用其它保藏方法不理想，可用液氮保藏法。其保存期最长。原理：低温。用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达-196，远远低于其新陈代谢作用停止的温度(-130)，所以此时菌种的代谢活动已停止，化学作用亦随之消失。（5）悬液保藏法（寡营养保藏）：将微生物悬浮在不含养分的溶

15、液中，如水、缓冲液、生理盐水，室温保藏，一般为一年。适用于丝状真菌、酵母及肠道细菌。原理：寡营养。（6）低温保藏法：-20，-40，-80低温冰箱保藏。（7）石蜡油封存法：向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。此法可适用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。原理：低温、缺氧。（8）自然基质保藏法。菌种的复壮是指创造一个适合原菌株生长繁殖的条件，经分离纯化，淘汰退化型个体或挑出原种型个体的选育菌种的方法。菌种的复壮措施：（1）纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）；（2）通过寄主体内生长进行复

16、壮；（3）淘汰已衰退的个体。微生物的代谢类型：分解代谢和合成代谢。代谢调节是指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用，即自我调节。微生物代谢的控制是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。代谢（自我）调节方式：细胞透性的调节、代谢途径区域化、代谢流向的调控、代谢速度的调控。调节部位：细胞质：糖酵解、磷酸戊糖途径、糖原合成、脂肪酸合成；线粒体：丙酮酸氧化、三羧酸循环、B-氧化、呼吸链电子传递、氧化磷酸化；细胞核：核酸合成；内质网：蛋白质合成、磷脂合成。酶活性的调节：酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的

17、改变来调节其催化反应的速率。影响因素：底物和产物的性质和浓度、环境因子、其他的酶的存在。酶活性调节方式：酶的激活作用和酶的抑制作用。激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。前体激活指代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代谢中间产物的反馈激活，指代谢中间产物对该代谢途径的前面的酶起激活作用。抑制：由于某些物质的存在， 降低酶活性的现象。反馈抑制：是指代谢的末端产物对酶（往往是代谢途径中的第一个酶）活性的抑制。抑制可以是不可逆的，这将造成代谢作用的停止；抑制也有可逆的，当抑制

18、剂除去后，酶活性又恢复。在代谢调节过程中所发生的抑制现象主要是可逆的，而且大多属于反馈抑制。分支代谢的反馈调节方式有多种：顺序反馈抑制、同工酶的反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制、超相加反馈抑制、酶活性的调节。酶活性调节的机制：有变构调节理论、化学修饰作用、缔合与解离、竞争性抑制等。酶合成调节（酶量调节）的类型：包括诱导和阻遏两种类型。诱导：是指在某种化合物作用下，导致某种酶合成或合成速率提高的现象。阻遏：是在某种物质作用下导致某种酶合成停止或合成速率降低的现象。酶合成的诱导与阻遏同时存在于微生物中，通过它们的协调作用能有效地控制胞内酶量变化。1.酶合成的诱导作用：在微生物里，酶可以分成诱导

19、酶与组成酶两大类。组成酶：是机体内一类不依赖于酶的底物或底物结构类似物的存在而合成的酶,如EMP途径的一些酶。诱导酶（又称适应酶）：是一类依赖于底物或底物结构类似物的存在而合成的酶。如：乳糖酶。决定诱导酶合成的基因以隐性状态存在于染色体中。诱导剂：能够诱导某种酶合成的化合物称为该酶的诱导剂。诱导剂可以是被诱导的酶的底物或底物的结构类似物。阻遏酶合成的物质称为阻遏物。2. 酶合成的阻遏：终点产物（末端产物）反馈阻遏：如果阻遏物是被阻遏生成的酶(或酶系)所催化生成的终点产物，则这种阻遏现象称为终点产物（末端产物）反馈阻遏。这种阻遏现象主要发生在合成代谢途径上。这种现象最初是在大肠杆菌合成甲硫氨酸的

20、途径中被发现的。如果在培养基中加入过量的甲硫氨酸时，则这些酶系的合成都同时被阻遏。代谢产物反馈阻遏：如果阻遏物是其分解代谢的产物，则称为分解代谢产物阻遏。 枯草杆菌二峰生长机理：由于利用葡萄糖的酶系是固有的，而利用乳糖（或阿拉伯糖、半乳糖等）的酶系是诱导生成的。在有葡萄糖的情况下，阻遏了利用乳糖的酶系的合成。因而只有当葡萄糖被利用完之后，乳糖才能诱导能利用它的酶系合成，由于合成新酶系需要一定的时间，所以在二次生长之间出现了一段停滞期。酶活性调节与酶量调节区别：1.从调节方式上是不同的。酶活性调节：是对现有的酶在活性变化上进行调节，它不会涉及酶量的变化，酶量的调节：不涉及现有酶活性的变化，只是通

21、过影响酶合成或酶合成速率以控制酶量变化，达到控制代谢过程的目的。2.从调节作用的特点上看：酶活性调节的效果既及时又迅速，但由于酶量调节涉及到酶蛋白合成，它调节的效果较慢。初级代谢与次级代谢初级代谢：是为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子的各种相互关联的代谢网络，对菌的生长是必需的。产物有单糖、核苷酸、脂肪酸、蛋白质、核酸、多糖、脂类等等。次级代谢：次级代谢主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌的生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，通常是在生长后期开始形成的。次级代谢产物主要有抗生素、维生素、生物碱、色素、毒素等等。 次级代谢的调节方式：（1）初级代谢对次级代谢的调节；（2）碳

22、代谢物的调节作用；（3）氮代谢物的调节作用；（4）磷酸盐的调节作用；（5）次级代谢中的诱导作用及产物的反馈作用；（6）次级代谢中细胞膜透性调节；工业发酵的目的：大量积累人们所需要的微生物代谢产物。代谢的人工控制：人为地打破微生物的代谢控制体系，使代谢朝着人们希望的方向进行。人工控制代谢的手段：控制发酵条件（生物化学方法）；改变微生物遗传特性（遗传学方法）；改变细胞膜透性。发酵条件的控制：1.各种发酵条件对微生物代谢的影响；2.使用诱导物；3.添加生物合成的前体。前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物，能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。如青霉素G

23、的生产中，苯乙酰-CoA是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。前体与诱导物的区别：有时难于区分促进作用是诱导物的作用还是前体的作用。一般，可把那些能在生长期内、生产期前促进产物合成的化合物看做诱导物，而前体往往只在生产期内起作用。另外，诱导物可以被非前体的结构类似物取代。培养基成分和浓度的控制：在考虑培养基组成与各组成成分的比例时，要保证能够满足机体生长的需要，要有利于代谢产物的形成，同时还要尽量避免使用容易引起分解代谢产物阻遏的成分或避免使用高用量的物质。在发酵培养基中通常是采用有适量速效碳源或氮源，以促进机体的生长；又要有充足的迟效碳源或氮源，以利于发酵产物的形成，从而

24、也可以避免速效碳源或氮源在机体内产生分解代谢产物阻遏。例如用甘油代替果糖作碳源培养嗜热脂肪酵母，可以使淀粉酶产量提高25倍以上。代谢工程：代谢工程是指利用基因工程技术，定向地对细胞代谢途径进行修饰、改造，以改变微生物的代谢特性，并与微生物基因调控、代谢调控及生化工程相结合，构建新的代谢途径，生产新的代谢产物的工程技术领域。代谢工程三种方式：改变代谢途径、扩展代谢途径、构建新的代谢途径。改变代谢途径是指改变分支代谢途径的流向，阻断其他代谢产物的合成，以达到提高目标产物的目的。改变代谢途径有各种方法，如加速限速反应、改变分支代谢途径流向、构建代谢旁路、改变能量代谢途径等不同方法。培养基按其他特殊用

25、途划分：1.孢子培养基；2.种子培养基；3.发酵培养基（配置要求）。1.孢子培养基：孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是：能使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。所以对孢子培养基的基本配制要求是：（1）营养不要太丰富（特别是有机氮源），否则不易产孢子。（2）所用无机盐的浓度要适量，不然也会影响孢子量和孢子颜色。（3）要注意孢子培养基的pH和湿度。常用培养基有：麸皮培养基、小米培养基、大米培养基、玉米碎屑培养基和用葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、食盐等配制成的琼脂斜面培养基。2.种子培养基：种子培养基是供孢子发芽、生长和菌体繁殖的。所以

26、种子培养基的营养成分要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也要高些，提供速效碳源。3. 发酵培养基：发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。因此，发酵培养基的组成除了有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。发酵培养基的要求：（1）培养基能够满足产物最经济的合成。（2）发酵后所形成的副产物尽可能的少。（3）培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。（4）所选用的培养基应能满足总体工艺的要求。二、 发酵培养基的

27、成分及来源：一、碳源：1.作用：提供微生物菌种的生长繁殖所需的能源和合成菌体所必需的碳成分，提供合成目的产物所必须的碳成分。2.来源：糖类、油脂、有机酸、正烷烃。 工业：（1）糖蜜；（2）淀粉、糊精。二、氮源：氮源主要用于构成菌体细胞物质（氨基酸，蛋白质、核酸等）和含氮代谢物。常用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。1.无机氮源种类：氨盐、硝酸盐和氨水。特点：微生物对它们的吸收快，所以也称之谓迅速利用的氮源。2.有机氮源来源：工业上常用的有机氮源都是一些廉价的原料，花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉、玉米。有机氮源和无机氮源应当混合使用。早期：容易利用易同化的氮源无机氮源中期：菌体的代谢酶系已形

28、成、则利用蛋白质前体青霉素：分子量356，苯乙酸：分子量136。实际使用时的转化率在46-90%之间。用法：采用流加的方法。前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利前体相对价格较高，添加过多，容易引起挥发和氧化，流加也有利于提高前体的转化率。产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。三、发酵培养基的设计和优化：一、培养基成分选择的原则：菌种的同化能力、代谢的阻遏和诱导、合适的C、N比、pH的要求。培养基中碳氮比的影响极为明显。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量，碳源过多，则容易形成较

29、低的pH，若碳源不足，易引起菌体衰老和自溶。 一般工业发酵培养基的C：N 为100：0.22.0，谷氨酸产生菌的C：N 为100：1521。（二）实验设计：培养基成分的含量最终都是通过实验获得的。合理的实验方法：多因子实验：均匀设计、正交实验设计、响应面分析等；单因子实验。培养基设计的步骤：（1）根据前人的经验和培养基成分确定一些必须考虑的问题，初步确定可能的培养基成分；（2）通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；（3）当培养基成分确定后，剩下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数常采用一些合理的实验设计方法如正交实验设计、响应面分析法。 补料的作用：（1）丰富

30、培养基，避免了菌体过早衰老，使产物合成的旺盛期延长；（2）控制了pH值和代谢方向；（3）改善了通气效果，避免了菌体生长可能受到的抑制；（4）补料还能补足发酵液的体积。种子扩大培养是指将保存的处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。这些纯种培养物称为种子。目的：使发酵周期缩短，设备利用率提高。作为种子的准则是:（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短.（2）生理性状稳定。（3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求。（4）无杂菌污染。（5）保持稳定的生产能力。种子罐的作用在于使孢子瓶中有限数量的孢子发芽、生长并

31、繁殖成大量菌丝体，接入发酵罐培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于产物的合成。种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数，这一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。（2）接种龄与接种量接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度。通常接种量，细菌15%，酵母菌510%，霉菌715%，有时2025%。接种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种龄以菌

32、丝处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时较为合适。影响孢子质量的因素及控制：培养基、培养条件、培养时间和冷藏时间、接种量、接种龄。种子质量的控制措施：种子质量的最终指标是考察其在发酵罐中所表现出来的生产能力。因此首先必须保证生产菌种的稳定性，其次是提供种子培养的适宜环境保证无杂菌侵入，以获得优良种子。菌种稳定性的检查：无（杂菌）检查：种子异常分析：菌种生长速度，过快或过慢（培养基）、菌丝结团（溶氧）、菌丝粘壁（搅拌）。所谓菌丝粘壁是在种子培养过程中，菌丝正常发育生长，但再继续培养时菌丝逐步黏附在罐壁上。当菌丝繁殖的速度低于被罐壁黏附的速度时，培养液中菌丝浓度越来越小，

33、最后就可能形成菌丝团。菌丝粘壁的原因是搅拌效果不好搅拌时泡沫过多，以及种子罐的装料系数过小等。在以真菌为产生菌的种子培养过程中，发生菌丝粘壁的机会较多。7.1 温度对发酵的影响及其控制（发酵工艺控制）1.温度对微生物细胞生长的影响：温度对菌生长和生产的影响是各种因素综合表现的结果。从酶动力学来看，温度升高反应速率加大，生长代谢加快，生产期提前。但因酶本身很易因热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现在菌体易于衰老，发酵周期的缩短，影响产物的最终产量。2.温度对产物形成的影响：活化能E的大小说明酶反应速率受温度大小影响而变化。根据公式可测得青霉菌生长的活化能E34kJmol，呼吸的活化能E1

34、16kJmol；青霉素合成的活化能E112kJmol。从这些数据可见，青霉素合成速率对温度最为敏感。3.温度影响发酵液的物理性质：温度除了直接影响发酵过程中各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质，间接影响菌的生物合成。例如温度会影响基质和氧在发酵液中的溶氧和传递速率，菌对某些基质的分解吸收速度等。4.温度影响生物合成的方向：温度还会影响生物合成的方向。例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30温度下，该菌种合成金霉素能力较强。当温度提高，合成四环索的比例也提高。在温度达35则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。影响发酵温度的因素：发酵热。发酵过程中，随着菌对培养基的利用，以及机

35、械搅拌的作用，将产生一定热量，同时因罐壁散热，水分蒸发等也带走部分热量。发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。Q发酵Q生物Q搅拌Q蒸发Q辐射。最适温度的选择与发酵温度的控制：选择最适发酵温度应该考虑两个方面：微生物生长的最适温度和产物合成的最适温度。发酵温度的控制：小型发酵罐通过夹套控制温度，大型发酵罐通过冷却盘管控制温度。7.2 pH值对发酵过程的影响及控制7.2.1 pH值对发酵过程的影晌1.微生物生长和生物合成都有其最适pH及其能够耐受的pH范围。2.pH会影响菌体的形态。3.pH对某些生物合成途径有显著影响。（1）生长阶段：在菌体生长阶段pH有上升或下降的趋势。（2）生产阶段：在生产阶

36、段，pH趋于稳定，维持在最适产物合成的范围。（3）自溶阶段：菌丝自溶阶段，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶的活跃，培养液中氨基氮增加，致使pH又上升，此时菌丝趋于自溶而代谢活动终止。引起发酵液中pH下降的因素有：（1）培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而pH下跌。（2）消沫油加得过多。（3）生理酸性物质的存在，氨被利用，pH下降。引起发酵液中pH上升的因素有：（1）培养基中碳、氮比例不当，氮源过多，氨基氮释放，使pH上升。（2）生理碱性物质存在。（3）中间补料中氨水或尿素等的碱性物质的加入过多使pH上升。7.2.3 最适pH的选择和

37、调节选择合适pH值的准则是有利于菌的生长和产物合成以获得较高的产量。最适pH与菌株，培养基组成，发酵工艺有关。在发酵过程中可通过以下方式来控制pH：（1）调节基础培养基的配方：调节碳氮比（C/N）；添加缓冲剂。（2）补料控制：直接加酸加碱；补加碳源或氮源。7.3 氧气对发酵的影响及其控制溶氧（DO）是需氧微生物生长所必需的。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往最易成为控制因素。这是由于氧在水中的溶解度很低造成的。临界氧浓度（C临）：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度，或微生物对发酵液中溶解氧浓度的最低要求。只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。如果

38、溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢受到干扰。7.3.1溶氧作为发酵异常情况的指示（1）发酵中污染好气性杂菌。（2）中间补料是否得当可以从溶氧变化看出。（3）操作故障或事故引起的发酵异常现象，也能从溶氧变化中得到反映。8.3.2 作为质量控制指标发酵过程的溶氧变化：发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降。发酵中后期：溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等。发酵后期：由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升。8.3.3发酵液中的溶氧控制控制溶氧水平从氧的供需着手。OTR=KLa (C*-CL)OT

39、R为单位体积发酵液氧的传递速率；kL为氧传质系数；a为比表面面积； kLa体积溶氧系数；c*为氧在水中的饱和度；cL为发酵液中的溶氧浓度；kLa和c*提高的因素都能使供氧提高。c*提高可采取下列办法：（1）在通入的空气中掺入纯氧,使氧分压增高；（2）提高罐压；（3）改变通气速率，其作用是增加液体中夹持气体体积的平均成分。Kla反映了设备的供氧能力。影响Kla的因素：搅拌、空气流量、发酵液性质、微生物生长、消泡剂、离子强度搅拌的作用：（1）打散气泡，增加气液相的有效接触面积；（2）形成涡流，延长气泡在液体中的停留时间；（3）增加液体大湍动程度，减少气体传递阻力；（4）使培养液中的成分均匀分布。空

40、气流量越大，kLa越大，但有一定的限度。细胞浓度与kLa反比关系。消泡剂暂时引起DO的下降，但最终会改善通气。电解质浓度越大，kLa越大。7.4 二氧化碳对发酵的影响及其控制CO2对发酵的影响：（1）对发酵促进；（2）对发酵抑制；（3）影响发酵液的酸碱平衡。二氧化碳浓度的控制：提高通气量和搅拌速率，有利于CO2的排出。降低通气量和搅拌速率，有利于提高CO2在发酵液中的浓度。补糖可降低发酵液中CO2的浓度，并降低培养液的pH值7.5 泡沫对发酵的影响与控制泡沫产生的原因：（1）由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌）；（2）发酵过程中产生的气体聚结生成（发泡性物质）。 泡沫的影响：有利：由

41、于这些泡沫的存在可以增加气液接触面积，导致氧传递速率增加。有害：（1）降低了发酵罐的装料系数；（2）增加了菌群的非均一性；（3）增加了污染杂菌的机会；（4）导致产物的损失；（5）消沫剂的加入将给提取工序带来困难。 泡沫的消除和防止：泡沫控制的方法可归结为机械消沫和消沫剂消沫两大类。也有从微生物本身的特性着手，防止泡沫的形成，如选育或混养。一种好的消沫剂最好能同时降低液膜的机械强度和降低液膜的表面粘度。染菌原因：发酵染菌的防止一、种子带菌的原因及防止1.带菌的原因：无菌室的无菌条件不符合要求、培养基灭菌不彻底、操作不当.2.种子带菌的防止：严格控制无菌室的污染；对每一级种子进行严格的无菌检验；种

42、子培养基和器具严格灭菌。二、空气带菌的防治主要是完善空气净化系统、加强卫生管理、设计合理的空气预处理工艺、设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。三、操作失误导致的染菌防治三、培养基或设备灭菌不彻底导致染菌的防治四、发酵设备、管件的渗漏或卫生死角导致的染菌防治引起噬菌体感染的原因：设备的渗漏；空气系统、培养基灭菌不彻底。预防噬菌体感染的措施：1.发酵罐的排气管要用汽封或引入药液槽中。2.取样、洗罐或倒罐的带菌液体要处理后才允许排入下水道。3.把好种子关，实现严格的无菌操作。4.搞好生产场地的环境卫生。判断发酵是否染菌应以无菌试验结果作为依据。不同染菌时间对发酵的影响：种子培养期染菌：菌体浓

43、度低、培养基营养丰富。发酵前期染菌：杂菌与生产菌争夺营养成分，干扰生产菌的繁殖和产物的形成。发酵中期染菌：严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成。发酵后期染菌：如杂菌量不大，可继续发酵。如污染严重，可采取措施提前放罐。如何判断发酵终点：发酵过程的参数检测参数可分为四类：物理参数、化学参数、生物参数和间接参数。发酵过程的参数测量形式又可分为：在线测量和离线测量。在物理参数中，温度、压力、流量、转速、补料速度和泡沫位是发酵过程中最重要的，需随时检测和控制的参数，它们可以直接在线测量和控制。在化学参数中，pH、溶氧和尾气组成可以在线检测，溶液成分的测定一般难于在线进行。间接参数是由以上参数经计算得到的。如

44、对发酵尾气组分分析获得的数据进行计算，可以得到好氧速率、二氧化碳释放率和呼吸商，进而会计算出菌体浓度和基质消耗速率等。另外，如呼吸强度、氧传递系数、比生长速率、菌体生长速率、产物得率等都可以通过间接计算的方法获得。传感器通常是指能够将非电量转换为电量的器件，它实质上是一种功能块。传感器的作用是感受被测量的变化，并直接从被测对象中提取检测信息，也即将来自外界的各种信号转换成电信号。发酵工业用的传感器应满足的要求：（1）传感器能经受高压蒸汽灭菌；（2）传感器及其二次仪表具有长期稳定性；（3）最好能在过程中随时校正；（4）探头材料不易老化，使用寿命长；（5）探头安装使用和维修方便；（6）解决探头敏感

45、部位被物料（反应液）粘住、堵塞问题；（7）价格合理，便于推广应用。物理参数：主要有温度 、生物热、搅拌速度和搅拌功率、通气量、罐压、发酵液粘度、消沫剂和发酵液计量等。温度测量系统主要由感温元件和二次仪表组成。感温元件一般装置在金属套管中，再插入发酵罐中或沿发酵罐罐壁固定，安装时必须注意保证发酵罐的无菌状态。二次仪表：选择二次仪表时，应考虑温度范围，型号是否与选用的热电阻相匹配。在发酵过程中，搅拌起着传递功率，加强液体翻动，促进热量、质量和动量传递，提高溶氧水平的作用。据作用原理，测量空气流量的流量计分为两大类：体积流量型和质量流量型。常用的泵有各种计量泵、微量泵和蠕动泵。液位探针主要用于两种情

46、况：在连续培养中以稳定液面和在通气发酵中判断泡沫的产生情况。化学参数检测：化学参数主要包括：pH值、溶解氧浓度、二氧化碳浓度、细胞浓度、基质浓度、产物浓度等。1.pH的测量：对于因菌体代谢所引起的pH变化，如果不加控制的话，必然要干扰微生物反应的正常进行。发酵过程测量pH用的电极要求结构紧凑，故常用把指示电极和参比电极合为一体的复合型pH玻璃电极。发酵用的复合pH电极必须满足的特殊要求：电极必须能耐高温灭菌、具有长时间稳定性、要求结构紧凑、便于安装和耐受压力。如何正确使用pH电极：（1）校准；（2）灭菌；（3）校准的检查。溶解氧的测量常用的电极：复膜氧电极。根据发酵过程实际使用要求，对氧电极具

47、有如下要求：（1）在长时间内能稳定工作；（2）电极输出电流足够大并与DO成正比；（3）电极功能受液流影响小；（4）电极响应快速灵敏；（5）测量时不易受培养基中温度的影响；（6）电极必须能耐高温（不超过120）灭菌消毒；（7）电极应具有合理的结构和合适的外形。电极的指示读数：（1）百分饱和浓度表示法：这种方法是目前实际生产中最常用的方法。（2）氧分压表示法。（3）氧浓度表示法。5.菌浓度的测量：（1）浊度法。在设计使用中应注意如下几个问题：1）传感器（流通式薄层比色杯）壁生长问题。2）气泡对浊度测量的影响。3）灭菌操作问题。（2）荧光测量。发酵过程的自动控制包括三方面内容：1.与发酵过程的未来状

48、态相联系的控制目标。2.一组可供选择的控制动作。如阀门的开关等。3.能够预测控制动作对过程状态影响的模型。微生物反应动力学：研究各种环境因素与微生物代谢活动之间相互作用随时间而变化即生物反应速度的规律。研究内容：描述发酵过程中细胞生长速率、基质利用速率和产物生成速率。发酵过程按进行过程有三种方式：分批发酵、补料分批发酵、连续发酵。1.分批发酵的定义：分批培养指的是一次投料，一次接种，一次收获的间歇培养方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。2.分批发酵的特点：微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生

49、物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。3.分批发酵的优缺点：优点：操作简单；操作引起染菌的概率低;不会产生菌种老化和变异等问题。缺点：非生产时间较长、设备利用率低。根据产物形成与底物利用的关系，即碳源利用与产物形成速度的关系，把微生物（分批）发酵过程分成了三个类型。（1）第一类型（生长相关型）：特点：菌体生长、碳源利用和产物形成几乎都在相同的时间出现高峰，即表现出产物形成直接与碳源利用有关。产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产物形成不分开。又分为两种情况，即菌体生长类型和代谢产物类型。所谓菌体生长类型指的是终产物就是菌体本身，菌体增加与碳源利用平行，且两者有定

50、量关系。例如酵母、蘑菇菌丝、苏云金杆菌。代谢产物类型指的是产物的积累与菌体增长相平行，并与碳源消耗有准量关系。如酒精、乳酸等。 （2）第二类型（生长部分相关型）：特点：在发酵的第一时期菌体迅速增长，而产物的形成很少或全无；在第二时期，产物以高速度形成，生长也可能出现第二高峰，碳源利用中这两个时期都很高。产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰。例如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。（3）第三类型（生长不相关型）：特点：产物形成一般在菌体生长接近或达到最高生长时期，即稳定期。产物形成与碳源利用无准量关系，产量远远低于碳

51、源的消耗量。产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级代谢是分开的。次级代谢产物如抗生素、维生素多属此类。分批发酵的分类对实践的指导意义：从上述分批发酵类型可以分析：如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长稳定期，以提高产量。分批培养动力学：细胞生长动力学、基质的消耗动力学、产物的生成动力学。细胞生长动力学：分批培养分为：延滞期、对数生长期、减速期、稳定期（静止期）和衰亡期。1.延滞期：

52、刚接种后的一段时间内，几乎未见菌体浓度的增加，这过程一般称为延滞期或适应期。工业生产要求尽可能缩短延滞期。该期长短取决于菌种遗传性状、菌龄、接种量、接种前后培养条件的差异等。（菌龄短的菌种延迟期较短，对菌龄相同的菌种，接种量越大则延迟期越短。）缩短该期方法：用相同培养基中的对数期的细胞接种到培养基中，反之，老培养、不同培养基中的培养物接种，就会增加延滞期。2.对数期：在这一阶段中，由于培养基中的营养物质比较充足，有害代谢物很少，所以细胞的生长不受到限制，细胞浓度随培养时间指数增长，称为指数生长期，也称对数期。 培养液中的细胞浓度愈大，细胞浓度的增长速率也就愈大。细胞浓度的变化率与细胞浓度成正比

53、。比生长速率与细胞种类，培养温度、pH、培养基组成和限制性基质浓度等因素有关。3.减速期：细胞的比生长速率逐渐下降。从指数生长到生长稳定期有一过渡，称为减速期，减速期的长短取决于菌对限制性基质的亲和力，例如对基质的亲和力高，则减速期将很短，反之，则长。4.稳定期（静止期）：当细胞浓度达到最大值，生长速率下降到零时，便进入该期，这一时期菌体代谢十分活跃，许多次级代谢产物在此期合成。因此也被称为生产期或分化期。5.衰亡期：细胞开始死亡，活细胞的浓度不断下降。分批培养中基质的消耗动力学如果限制性基质是碳源，消耗的碳源中一部分形成细胞，部分形成产物，一部分形成能量。补料分批发酵1.定义：补料分批发酵又

54、称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。2.补料分批发酵的优缺点：优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度；不会产生菌种老化和变异等问题。缺点：存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。连续发酵1.定义：在培养过程中，连续的向发酵罐中加入培养基，同时以相同流速从发酵罐中排出含有产品的培养基，这种操作方式称为连续培养。2.连续发酵的优缺点：优点：（1）可以提高设利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间。（2）发酵中各参数趋于衡值，便于自动控制。（3）易于分期控制。可以中不同的罐中控制不同的条件。缺点：（1）容易染

55、菌：发酵周期长，杂菌污染机会多。（2）容易引起菌种的变异，使生产能力下降：长时间的培养，也就是多次数的传代，培养条件的变化等。3.连续发酵的类型：按设备：可分为罐式、管式；按控制方法：恒成分培养、恒浓度培养；按菌种：循环式、非循环式；按发酵罐的级数：单级或多级连续培养。单级连续培养中进入稳定状态后，细胞的（比生长速率）与D（稀释率）相等。发酵液、反应液或培养液中分离、精制有关产品的过程称为下游加工过程。微生物工程下游加工工程的特点：（1）培养液中所含欲提取的生物物质浓度很低，杂质含量却很高；（2）下游加工过程的代价昂贵，回收率不高；（3）欲提取的生物物质通常很不稳定。遇热、极端pH、有机溶剂会

56、引起失活或分解；（4）发酵或培养都是分批操作、生物变异性大，各批发酵液不尽相同，这就要求下游加工有一定的弹性，特别是对染菌的批号，也要能处理。微生物工程下游加工工程的一般程序可分为4个阶段：（1）培养液（发酵液）的预处理和固液分离；（2）初步纯化（提取）；（3）高度纯化（精制）；（4）成品加工。 选择下游加工工艺的原则：（1）是胞内产物还是胞外产物；（2）原料中产物和主要杂质浓；（3）产物和主要杂质的物理化学特性及差异；（4）产品用途和质量标准；（5）产品的市场价格；（6）废液的处理方法等。发酵液预处理的目的：改变发酵液的物理性质，加快悬浮液中固形物沉降的速度；尽可能使产物转入便于以后处理的相中（多数是液相）；能够除去部分杂质。高价无机离子的去除方法：Ca2：草酸。Mg2：。Na5P3O10三聚磷酸钠。Fe3：黄血盐。可溶性杂蛋白的去除方法：1.等电点：蛋白质不