幼儿园优秀教学案例及分析研究.ppt

1、,主题：幼儿园英语教学案例分析,Pumpkin and Jack-O-Lantern（大班）,活动目标 ：,1使用英语描述南瓜 和南瓜灯的特点。,2体验万圣节的独特 受节日游戏的乐趣。,Back,1在活动室四周的墙壁上装饰南瓜、巫婆、蝙蝠、黑猫、鬼、骷髅、黑蜘蛛等。 2南瓜形状的纸板每人一个。 3教师事先用南瓜形状的纸板制作“高兴”“悲伤”“恐惧”“生气”四种不同表情的南瓜灯。,活动准备：,Back,活动过程：,教师出示“Pumpkin（南瓜） ”和“Jack-O-Lantern（南瓜 灯）”，引导幼儿学习英语句 型“They are different”。,教师引导幼儿区分和表达南 瓜和南瓜

2、灯的特点。,教师采用比较的方法，出示 大小不同的蝙蝠，引导幼儿 学习英语句型“They are the same”。,1学习句型“They are the same”和 “They are different”。,活动过程：,教师出示“高兴”“悲伤” “恐惧”“生气”四种不同表情 的南瓜灯，请幼儿说出它们 的英语词汇。,幼儿制作南瓜灯。教师巡回 观察，并问幼儿：“你想做哪 种表情的南瓜灯，高兴，悲 伤，恐惧，还是生气？”,全班幼儿每人制作一个南 瓜灯。,2制作南瓜灯。,教师请装扮成妖魔鬼怪的幼儿手 提自己制作的南瓜灯，到观摩该 教育活动的教师跟前，与他们玩 “trick or treat（恶作

3、剧，还是款待 ）”游戏。一些幼儿对这个游戏感 到陌生，只是跟着教师唱“Trick or treat.Smell my feet.Give me some thing good to eat”，但没有 按照教师的指令行动。只有部分幼 儿到观摩该教育活动的教师跟前玩 游戏。游戏在进行1分半钟后结束。,活动过程：,3“trick or treat”游戏。,Back,在本案例中，教师不恰当的指导语影响幼儿用英语进行创造性表达。“教师的指导可以避免使学生陷入定势模式，从而为他们带来一定的成功。” 教师作为幼儿园英语教学活动的组织者，其指导与建议对幼儿用英语进行创造性表达会产生重大影响。有时因为教师一句不

4、恰当的指导语，幼儿可能会失去思考、创造的机会。在本案例中，制作南瓜灯环节应该是幼儿用英语进行创造性表达的好时机，但是教师不恰当的指导干扰了幼儿用英语进行创造性表达的兴趣。教师在巡回观察时规定了幼儿只能从“高兴”“悲伤”“恐惧”“生气”四种表情中选择一种表情制作南瓜灯，限制了幼儿的创造性表现，不利于幼儿学习用英语表达更多的表情词汇。,活动总结：,在案例二的最后环节，教师组织幼儿玩“trick or treat”游戏。这是幼儿与观摩该教育活动的教师互动的环节，教师希望在模拟真实情景的游戏中让幼儿“体验万圣节的独特气氛，感受节日游戏的乐趣”。但由于一些幼儿对游戏感到陌生，所以他们对教师的要求没有作出

5、积极回应，只是跟在教师身边唱歌，游戏活动仓促结束。这是因为教师在组织活动时忽视了幼儿对隐含在教育活动中的多元文化的感悟，导致幼儿对异国的万圣节活动感到陌生，无法全身心投入活动，体会不到活动的乐趣。,活动总结：,在上述两个案例中，教师虽然具有将英语活动融入幼儿园课程整体的理念，但在将理念转化为实际教育行为方面存在欠缺。案例一中，教师试图整合数学活动与英语活动，但是在制订活动目标、组织活动实施方面存在欠缺，没有制订出适合幼儿发展的活动目标，幼儿在活动中的提高有限；案例二的教师试图将英语活动与主题教育整合，但是未能使幼儿在中文主题课程中获得足以支撑英语学习的经验，限制了幼儿的创造性表现。 幼儿园缺少

6、合格的英语教师，缺少英语与中文主题整合的课程教材，教师在组织活动时忽视了对幼儿的多元文化导入等都会导致幼儿园英语教学活动中出现这种事与愿违的情况。只有解决了上述问题，才能提高教师设计与实施幼儿园英语教学活动的质量，在促进幼儿全面发展的同时提高幼儿的英语学习兴趣和英语运用能力。,案例评析：,本文观看结束！,谢 谢 欣 赏！,5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响,5-Aza-CdR对人食管癌细胞株生物学行为及TFPI-2 mRNA表达的影响 作者：杜雅冰，邵应举，樊青霞，孙桢，王琳，赵培荣 作者单位：(郑州大学第一附属医院肿瘤内科，河南郑州450002)

7、【摘要】目的探讨5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对食管鳞癌细胞株Eca9706生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathway inhibitor-2，TFPI-2)基因表达的影响。方法选取食管鳞癌细胞株Eca9706，并用不同浓度的5-Aza-CdR处理该细胞株。MTT法检测干预前后细胞增长率的变化，FCM法检测干预前后细胞凋亡率的变化，RT-PCR技术检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2基因mRNA的表达，免疫组化检测干预前后Eca9706细胞TFPI-2蛋白的表达。结果食管鳞癌细胞株Eca970

8、6存在TFPI-2基因超甲基化状态，经5-Aza-CdR处理后，超甲基化状态解除，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡率明显提高(P0.05);细胞中TFPI-2蛋白表达明显增强，同时mRNA的表达水平也较处理前明显提高(P0.05)。结论食管癌细胞系TFPI-2基因超甲基化可抑制其mRNA表达，当其超甲基化解除后，细胞增殖受到抑制，同时细胞凋亡率相应提高。,【关键词】 食管癌;组织因子途径抑制物-2;5-氮杂-2-脱氧胞苷;甲基化;免疫组化;逆转录聚合酶链反应;凋亡 ABSTRACT： ObjectiveTo explore the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine (

9、5-Aza-CdR) intervention on the growth and proliferation of Eca9706 cell line and protein expression of tissue factor pathway inhibitor-2 (TFPI-2). MethodsEca9706 cell line was treated by 5-azaCdR of different concentrations; MTT， flow cytometry， immunohistochemistry and RT-PCR were used to determine

10、 the cell growth， apoptosis， and the expression of TFPI-2 gene and its protein. ResultsEca9706 cell line had hypermethylation of TFPI-2. After demethylation by 5-Aza-CdR treatment， the proliferation of Eca9706 was inhibited， the apoptosis rate was also increased significantly in the concentration-de

11、pendent manner. RT-PCR detected that mRNA expression of TFPI-2 gene in Eca9706 cell line recovered significantly (P0.05). Conclusion5-Aza-CdR can slow the growth of Eca9706 cell， increase the apoptosis rate， reactivate the TFPI-2 gene transcription and protein expression by demethylation. KEY WORDS：

12、 esophageal carcinoma; tissue factor pathway inhibitor-2; 5-Aza-CdR; methylation; immunohistochemistry; RT-PCR; apoptosis,组织因子途径移植物2(tissue factor pathway inhibitor， TFPI-2)是丝氨酸蛋白酶抑制物，在调控肿瘤细胞浸润转移方面起着重要作用。目前，关于TFPI-2在食管癌中的基因表达情况的分析研究尚少。本研究旨在探讨TFPI-2基因的失活机制，并寻找食管癌治疗的新靶点。 1材料与方法 1.1材料 RPMI-1640培养基购自北京索

13、莱宝生物科技有限公司;标准胎牛血清购自天津市灏洋生物制品科技有限公司;Trizol试剂购自MBI公司;RT-PCR试剂盒购自MBI公司;5-Aza-CdR购自Sigma公司;人食管癌细胞株Eca9706由郑州大学肿瘤生物学研究室惠赠。 1.2细胞培养和药物处理 人食管癌细胞Eca9706以含10 mL/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，37 、50 mL/L CO2培养箱培养，每23 d消化传代1次。 1.3MTT法检测干预前后细胞增长率的变化 取对数生长期细胞，调整密度至5104/mL接种于96孔板，按5-Aza-CdR浓度分为6组：0、0.4、1.6、6.4、25.6、102.4 mo

14、l/L，每组复设5个孔。待细胞贴壁后，分别于24、48、72 h后加入MTT液，4 h后弃去上清液，每孔加DMSO 150 L，在490 nm波长测定各孔吸光度值(absorbance，A)。细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate， CPIR)按公式计算：CPIR=(1-实验组A均值/对照组A均值)100%。,1.4流式细胞仪(FCM)检测干预前后细胞凋亡率的变化 取对数生长期细胞，按5105/mL的密度接种于6孔板内，待细胞贴壁后加药，分组如下：对照组(0 mol/L),1.6 mol/L 5-Aza-CdR组，25.6 mol/L 5-

15、Aza-CdR组，102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。每组均于5-Aza-CdR作用48 h后消化收集细胞，700 mL/L冰乙醇固定，流式细胞仪进行细胞凋亡测定。 1.5RT-PCR技术检测TFPI-2基因mRNA的表达 分组同FCM，每组细胞均5-Aza-CdR作用48 h。TFPI-2的上、下游引物分别为5-GTCGATTCTGCTGTTTTCC-3和5-ATGGAATTTTC TTTGGTGCG-3，合成产物为440 bp;-actin作为内参照，上下游引物分别为5-AGGCATTGTGATGGACTCCG-3和5-AGTGATGACCTGGCCGTCAG-3，合成产物为30

16、1 bp。按照试剂盒说明书，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度计分析后，按Sigma公司RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作。先逆转录制备单链cDNA，再以逆转录产物为模板，用上、下游产物进行PCR反应扩增目的基因。反应条件为：94 预变性3 min，然后94 变性30 s,51 退火30 s,72 延伸30 s，循环30次，最后72 延伸5 min,4 保温。扩增片段经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。,1.6免疫组化方法检测TFPI-2蛋白的表达 取对数生长期细胞，按5104/mL的密度接种于经预处理的盖玻片上，待细胞贴

17、壁后加药(分组同RT-PCR)。培养48 h后加入40 g/L多聚甲醛溶液固定30 min,30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温下10 min,100 mL/L动物血清封闭，室温下10 min，滴加1100的稀释的TFPI-2抗体4 过夜，二抗室温下1 h，滴加辣根酶标记链霉卵白素，37 孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。另取爬片滴加PBS 液代替一抗作为阴性对照。结果判定：TFPI-2蛋白阳性信号均呈棕黄色颗粒样物质，位于细胞质内。光镜下随机选取10个视野(每个视野观察细胞数不少于100个)，按阳性细胞所占百分比进行结果判定。阳性率=(阳性细胞数/1 00

18、0)100%。 1.7统计学处理 应用SPSS16.0软件进行统计学处理。实验数据采用均数标准差(x-s)表示，采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析。检验水准=0.05。 2结果 2.1干预前后细胞增长率的变化 经MTT检测，结果显示，实验组细胞抑制率明显高于未加药组，且随着作用时间的延长和浓度的增加而增加(表1)。表1不同浓度的5-aza-CdR对Eca9706细胞增殖的影响,2.2干预前后细胞凋亡率的变化 流式细胞仪分析可见，经不同浓度5-Aza-CdR诱导48 h后，Eca9706细胞各处理组凋亡率分别为(13.760.47)%、(26.970.39)%、(41.030.19)%

19、，与5-Aza-CdR诱导浓度成正比。与对照组(1.390.27)%比较差异有统计学意义(P0.05)，且各浓度组间比较差异亦有统计学意义(P0.05，图1)。以上实验重复5次。 2.3干预前后Eca9706细胞mRNA的表达情况 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示，Eca9706细胞中TFPI-2 mRNA表达在各用药组和未用药组之间有明显差异，TFPI-2 mRNA在未用药组细胞中未见表达。经1.6、25.6、102.4 mol/L 5-Aza-CdR处理后可见TFPI-2 mRNA表达，表明在一定范围内随5-Aza-CdR药物浓度的增加TFPI-2 mRNA表达逐渐增强(图2)。图1各组流式细

20、胞凋亡散点图A：对照组;B：1.6 mol/L 5-Aza-CdR组;C：25.6 mol/L 5-Aza-CdR组;D：102.4 mol/L 5-Aza-CdR组。图25-Aza-CdR处理前后Eca9706细胞TFPI-2 mRNA的表达M：DNA marker;-actin：301 bp;TFPI-2：440 bp;1：对照组;2：102.4mol/L组;3：25.6 mol/L组;4：1.6 mol/L组;5：H2O对照组。,2.4干预前后TFPI-2蛋白的表达情况免疫组化结果显示，经5-Aza-CdR作用Eca9706细胞48 h，,TFPI-2蛋白的阳性表达率增加，对照组、1.6

21、 mol/L组、25.6 mol/L组、102.4 mol/L组TFPI-2蛋白的阳性表达率分别为(2.101.42)%、(9.312.70)%、(14.723.50)%、(68.203.20)%，不同浓度组之间以及用药组与对照组之间的差异均有统计学意义(P0.05，图3)。图3各组TFPI-2蛋白的表达情况 3讨论 人TFPI-2(hTFPI-2)基因定位于7q22区域，全长由8164个碱基组成，其cDNA全长为1 222 kb。其mRNA的启动子具有典型的管家基因特征，没有典型的TATA盒或CAAT盒，在推定的转录起始位点区域GC含量超过80%1。TFPI-2可在体内多种组织广泛表达，在这

22、些组织内一旦出现肿瘤，TFPI-2的表达水平也会随之显著下降2。有研究证实，在绒毛膜癌、乳腺癌、前列腺癌、神经胶质细胞瘤、纤维肉瘤和胸部恶性肿瘤组织中，与肿瘤产生相关的TFPI-2表达水平减少可能与其启动子的甲基化密切相关1,3-5。启动子区cpG岛高甲基化在肿瘤形成机制中的确切作用尚不清楚，然而众多证据表明，肿瘤抑癌基因CpG岛异常的甲基化导致基因失活和转录抑制是肿瘤发生的重要机制之一6-8。,目前，有体外实验表明，DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR通过去甲基化作用可使多种含有CpG岛的高甲基化抑癌基因重新表达，从而恢复抑癌功能9。本实验RT-PCR结果显示，TFPI-2在Eca970

23、6细胞中无表达，经过不同浓度的5-Aza-CdR处理Eca9706细胞后，TFPI-2亦重新出现表达，且在一定范围内随药物诱导浓度的增大表达逐渐增强。MIZUNO等10研究表明，肿瘤细胞中DNMT的表达较正常的高412倍，也证实DNMT上调参与肿瘤发生。这与我们的实验结果一致。根据MTT实验可知，经过5-Aza-CdR干预处理过的Eca9706细胞增殖明显受抑制，且随着药物浓度的增加，抑制作用越明显。从本实验结果分析，DNA启动子区去甲基化能较明显地抑制食管癌细胞增殖，并与其诱导剂量呈正相关，推测这种抑制作用与去甲基化后重新激活TFPI-2基因的转录和表达有着直接关系;此外可能与去甲基化后诱导

24、细胞凋亡有关。进而通过流式细胞仪分析，结果显示，经不同浓度5-Aza-CdR干预的Eca9706的细胞中，用药组与对照组相比细胞凋亡率凋亡率有所增加，并且与5-Aza-CdR诱导剂量有依赖性关系。BENDER等11在同等条件下用5-Aza-CdR处理恶性肿瘤细胞系和正常纤维细胞系时，发现肿瘤细胞增殖均被抑制，而纤维细胞增殖不被抑制。因此，5-Aza-CdR对Eca9706细胞增殖的抑制及凋亡的增加不是药物的毒性影响，可能是因为使TFPI-2重新表达的结果。,目前，国外以TFPI-2为药物研究靶点，就TFPI-2在肿瘤治疗、肿瘤临床诊断、促进伤口愈合和动脉粥样硬化治疗等领域中的应用，也正在进行广

25、泛深入的研究。本研究用甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理人食管癌Eca9706细胞株，检测TFPI-2基因表达的变化及其对细胞增殖和凋亡的影响，以期寻找治疗肿瘤的新靶点。 【参考文献】 1HUBE F， REBERDIAU P， IOCHMANN S， et al. Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line J. Thromb Res， 203， 109(4)：207-215. 2MIYAGIi Y， KOSHIKAWA N， Y

26、ASUMITSU H， et al. cDNA cloning and mRNA expression of a serine protein 5 and tissue factor pathway inhibitor-2 J. J Biochem， 1994， 116(5)：939-942. 3RAO CN， SEGAWA T， NAVARI JR， et al. Methylation of TFPI-2 gene is not the sole cause of its silencing J. Int J Oncol， 2003， 22(4)：843-848. 4KONDURI SD，

27、 SRIVENUGOPAL KS， YANAMANDRA N， et al. Promoter methyl and silencing of the tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2)， a gene encoding an inhibitor of matrix metalloproteinases in human glioma cells J. Oncogene， 2003， 22(29)：4509-416.,5STEINER FA， HONG JA， FISCHETTE MR， et al. Sequential5-Aza-2-deoxycytidi- ne/depsipeptide FK228 treatment induces tissue factor pathway inhibitor 2(TFPI-2) expression in cancer cells J. Oncogene， 2005， 24(14)：2386-2397. 6HERMAN JG， BAYLIN SB. Promoter-re