植物超氧阴离子自由基含量的测定

1、植物超氧阴离子自由基含量的测定一、实验目的学习测定植物组织中超氧阴离子自由基含量的方法二、实验原理进入生物体内的一些分子氧（O2），可经单电子还原转变为超氧阴离子自由基，特别是在逆境条件下这种单电子还原的几率更大。超氧阴离子即可直接作用于蛋白质和核酸等生物分子，也可衍生为羟自由基、单线态氧、过氧化氢及脂质过氧化物自由基等活性氧，引起对细胞结构和功能的破坏。因此测定逆境条件下植物组织中超氧阴离子自由基产生及清除速率，可间接了解组织细胞受损状况和抗性强弱。超氧阴离子自由基（O2-）能与羟胺反应，生成NO2-，NO2-能与对氨基苯磺酸和-萘胺反应生成粉红色的偶氮染料，该染料在530nm波长处具有显著

2、光吸收。因此利用羟胺氧化的方法可以测定植物组织中超氧阴离子自由基（O2-）的含量。三、器材与试剂1 实验仪器与用具研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（10mL）、分光光度计2 实验试剂65mmol/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）；提取缓冲液；10mmol/L盐酸羟胺溶液；58mmol/L对氨基苯磺酸溶液；7mmol/L -萘胺溶液；50mol/LKNO2标准溶液3 实验材料小白菜、小麦四、实验步骤1.制作标准曲线取7支试管，编号，按表1分别加入各种试剂，摇匀。置25保温箱20min。分别加入1mL 58mmol/L 对氨基苯磺酸溶液和1mL 7mmol/L-萘胺溶液，

3、混匀。25保温20min，以0号管为对照进行调零，立即在波长530nm处测定吸光度。以吸光度值为纵坐标，NO2-物质的量（5mol）为横坐标，制作标准曲线。表1 标准曲线试剂表试管号1234567NO2-标准液（5g/ml）00.20.40.81.21.62.0蒸馏水2.01.81.61.20.80.40对氨基苯磺酸2.0-萘胺2.02.提取取逆境处理的小白菜或者小麦叶片，正常条件下生活的叶片作为对照，剪碎混匀，分别称取1g样品，加入3ml提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆，于8000r、4离心10min，收集上清液，此液为植物O2-提取液。3.测定取2.0ml上清液，加入0.5ml 50mmo

4、l/L磷酸钾缓冲液（pH7.8）和0.1ml 10mmol/L盐酸羟胺溶液，摇匀，25保温20min。取出加入1ml 58mmol/L对氨基苯磺酸溶液和1ml 7mmol/L -萘胺溶液，混匀，30保温30min，加入等体积三氯甲烷萃取色素，10000r/min离心3min，取上层粉红色水相，测定530nm吸光度。表2 NO2-产生 O2-提取液（ml）2.0PBS（ml）1.5盐酸羟胺（ml）0.525保温20min表3 NO2-产生显色（同标准曲线）上诉反应液（ml）2.0对氨基苯磺酸（ml）2.0-萘胺（ml）2.030恒温箱中保温30min五、实验数据处理及分析根据样品管显色液与对照管

5、显色液吸光值的差值，从标准曲线上查出相应的NO2-的浓度，并换算成超氧阴离子（O2-）物质的量的浓度，从而计算出O2-的含量。O2-含量g/g=2xVtn/（FwVs）式中，n为羟胺氧化反应产生的NO2-（mol）；Vt为酶提取液总体积（mL）；Vs为羟胺氧化反应加入的粗酶提取液体积（mL）；Fw为样品鲜重（g）。试管1234567吸光度00.0960.2130.4450.6180.8050.970样 品白菜（空白）白菜麦子（空白）麦子鲜重1.178g1.016g吸光度0.1870.5230.0890.199由回归方程y=0.4906x+0.0151可得白菜中NO2-的浓度（5g/ml）为0.

6、654，小麦中NO2-的浓度（5g/ml）为0.193。白菜中O2-的含量（g/g）=2xVtn/（FwVs） =2100.654/(1.17825) =1.111白菜中O2-的含量（g/g）=2xVtn/（FwVs） =2100.193/(1.01625) = 0.六、讨论为什么O-2主要分布在小白菜的维管束中？ 通过观察可以发现，O-2主要分布在小白菜的叶柄和叶脉,即维管束中。植物在代谢过程中会产生许多活性氧自由基，线粒体是需氧生物细胞内产生O-2最多的地方。在整个电子传递链上传递大量电子时，已经有实验证实有些电子被漏出来，使氧气发生了电子还原而产生超氧阴离子自由基。维管束是指维管植物的维

7、管组织，由木质部和韧皮部成束状排列形成的结构。维管束彼此交织连接，构成初生植物体输导水分，无机盐及有机物质的一种输导系统。O-2产生的途径有很多，适宜浓度的O-2在体内有重要意义，参与吞噬细胞杀灭有害的微生物，协助清除衰老、褪变的细胞，消灭突变的细胞等。所以作为主要运输途径的维管束，O-2在其中的含量必然会很高。七、实验注意事项1、分光光度计应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。要先预热10min，用0试管中的样品进行调零，比色杯的外壁要擦干净。2、取待测样品研磨定容时，可对其质量及容积等体积放大，最好用纱布过滤，这样能保证上清液的澄清度。3、离心机在预冷状态时，离心机盖必须关闭。使用时注意先配平。4