边做边学大肠杆菌的接种与分离培养.ppt

1、微生物的培养与应用,要点,1.微生物、培养基的基础知识 2.无菌技术 3.平板划线法和稀释涂布平板法的比较,一、培养基的制备,1.基本成分,（1）碳源：,提供碳元素的物质，如CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、石油、花生粉饼等。,（2）氮源：,提供氮元素的物质，如N2、NH3、氨盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏、蛋白胨等。,（3）水：,细胞生命活动必不可少的物质，主要来源于培养基、大气、代谢产物。,（4）无机盐：,提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素的物质，主要来源于培养基、大气。,【方法点拨】不同种类的微生物对培养基中营养物质的需求不同,(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，

2、碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。,(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。,2培养基种类,（1）按物理性质分（是否加凝固剂琼脂）,培养基、 培养基、 培养基,（2）按化学成分分,天然培养基：,含化学成分不明的天然物质,合成培养基：,培养基成分明确或用一定化学物质配制,(3)按用途分,培养基：添加某物质，抑制杂菌生长，促进所需微生物的生长 培养基：根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂,3.配制原则,(1)目的要明确：,根据微生物种类、培养目的等确定配制的培养基种类。,(2)

3、营养要协调：,注意各种营养物质的浓度和比例。,(3)pH要适宜：,细菌为 ，放线菌为 ，真菌为 。,4培养基的制备,计算称量溶化 倒平板,液体,固体,半固体,选择,鉴别,6.57.5,7.58.5,5.06.0,灭菌,【例题讲解】,下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是(),A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基 B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨 C.该培养基缺少提供生长因子的物质 D.该培养基调节合适的pH后就可以接种使用,B,【解析】没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，

4、A项错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B项正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C项错误；培养基调节完pH还要进行灭菌等操作后，才能使用，D项错误。,二、无菌技术,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,无菌操作是培养微生物成功的关键！,（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒 ； （2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌 ； （3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近旁进行； （4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品 相接触。,1.主要方面,2.消毒与灭菌

5、的比较,温和,强烈,部分微生物,全部微生物,不能,能,煮沸消毒法:100煮沸5-6min 巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 化学药剂消毒法:用75%酒精进行皮肤消毒;氯气消毒水源 紫外线30min消毒：照射前，可喷石炭酸或煤酚皂等消毒液加强消毒效果,(1)消毒的方法：,3.常用的消毒与灭菌的方法,(2)灭菌的方法：,灼烧灭菌：接种环、接种针、试管口、瓶口,干热灭菌：玻璃器皿和金属用具,高压蒸气灭菌： 100kPa、121 下维持15-30min,问题1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？,还能有效避免操作者自身被微生物感染。,

6、问题2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。 （1） 培养细菌用的培养基与培养皿；（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管；（3） 实验操作者的双手,（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。,实验操作举例,（一）制备牛肉膏蛋白胨培养基,1 计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。,2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。,3 溶化：加水加热熔化牛肉膏；加入蛋白胨和氯化钠继续加热；加入琼脂；用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。,4.灭菌：将配制好的培养基转移到锥形

7、瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。,5.倒平板：待培养基冷却至50左右时在酒精灯火焰附近操作进行。,【方法点拨】倒平板的方法及注意事项,在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；,右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；,左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。,待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。,1.培养基灭菌后，需要冷却到50 左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？,可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。,2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌

8、，防止瓶口的微生物污染培养基。,问题讨论：,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,最常用的接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法。,1.平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表

9、面。 在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落。,分离后，一个菌体便会形成一个菌落，这是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选菌株的最简便方法之一。,【方法点拨】平板划线操作方法,1,2,3,4,5,6,7,8,接种环在火焰上灼烧直至烧红,火焰旁冷却接种环，打开菌液试管的棉塞。,将菌种试管口通过火焰,将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。,将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。,将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划35条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。,将平板倒置放在培养箱中培养。,【注意事项】,1.接种环只蘸一次菌液，但要在培养基不同位置连续划线多次。

10、,2.划线首尾不能相接。,3.划线后，培养皿倒置培养1224h。,从上次的末端开始，交叉23条,最后的划线不能与第一区相连。,1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？,第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,问题讨论：,2.在灼烧接种环之

11、后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.稀释涂布平板法,（1）系列稀释操作,将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。,注意：移液管需要经过灭菌。操作时，试管口和移液管离火焰12cm处。,（2）涂布平板操作,将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中,取少量稀释

12、液滴加到培养基表面,待酒精燃尽后冷却810s,用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀,问题讨论：,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等。,（三）、结果分析与评价,1.未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明什么？,培养未接种培养基作用是对照，有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。,大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。,2.接种大肠杆菌培养基上，独立菌

13、落颜色、形状、大小如何？,3.培养12h和24h后，观察到结果一样吗？如果不同，分析产生差异原因。,菌落大小不同；菌落分布位置相同。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。,4.如果你在培养基上观察到不同形态菌落，可能是哪些原因引起的？,培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。,四、平板划线法和稀释涂布平板法的比较,【知识点讲解】,【方法点拨】,1.稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目低。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。,2. 平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同：,第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。

14、,每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。,划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,【例题讲解】,1、下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题。,(1)图甲是利用_ 法进行微生物接种，图乙是利用_法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是_和_；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是_ 和酒精消毒。,(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？,_。,(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？,_。,平板划线,稀释涂布平板,接种环,涂布器,灼烧灭菌,火焰附近存在着无菌区域,避免培养

15、过程产生的水分影响微生物 的生长,【典型例题】,2、下列关于微生物接种的描述，正确的是() A.平板划线法只用于固体培养基的接种，而稀释涂布平板法只用于液体培养基的接种 B.平板划线法不能用于微生物的计数，而稀释涂布平板法可用于微生物的计数 C.利用平板划线法不能得到单菌落，而利用稀释涂布平板法能得到单菌落 D.平板划线法所用的接种工具不需要灭菌，而稀释涂布平板法所用的接种工具需要灭菌,【方法点拨】这两种接种方法都可用于固体培养基的接种，都能用于形成单菌落，接种器具都要进行严格灭菌处理。,B,【例题讲解】,3、微生物培养过程中，十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止

16、杂菌污染。请分析下列操作中错误的是(),煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢 接种操作要在酒精灯火焰附近进行 无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒 家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 培养基要进行高压蒸汽灭菌 加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌 A. B. C. D.,D,【方法点拨】家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。,4、细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌() A.接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环 C.培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅,【典型例题】,【方法点拨】灭菌是指彻底杀灭