课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 (11).ppt

1、土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数,课题2,课题目的,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,尿素简介,从土壤中分离出能够分解尿素的细菌,对分解尿素的细菌的计数 （统计每克土壤样品中究竟含有多少这样细菌）,尿素分子的立体结构,1.土壤取样 2.制备培养基 3.微生物的培养与观察 4.细菌的计数,怎样分离？,怎样计数？,研究思路,（一）筛选菌株,水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克（T.Brock) 1966年发现耐热细菌,选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,KH

2、2PO4 1.4g Na2HP04 2.1g MgS047H20 0.2g 葡萄糖 10g 尿素 1g 琼脂 3g,稀释涂布平板法,当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。也就是 说平板上一个菌落 代表一个活菌。,（也叫活菌计数法）,（二）分解尿素的细菌的计数,原理：,系列稀释操作,涂布平板操作,第一位同学在该浓度下涂布了一个平板，统计菌落数目为230。 第二位同学在该浓度下涂布了三个平板，统计菌落数分别为：21、212、256。该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。,你认为这两位同学的实验需要改进吗？如果需要如何改进？,两位同学用稀释涂

3、布平板法测定同一土壤样品细菌数，在对应稀释倍数为106倍的培养基中，得到以下两种统计结果：,统计记录,（二）分解尿素的细菌的计数,第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。,第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。,（二）分解尿素的细菌的计数,在设计实验时，一定要至少涂布三个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。,（二）分解尿素

4、的细菌的计数,101,（二）分解尿素的细菌的计数,为了保证结果准确，一般选择菌落数在30-300的平板进行计数,恰当的稀释度是成功统计菌落数目的关键。,稀释涂布平板法,土壤稀释,平板上的菌落数应为30300个，便于准确计数。,（二）分解尿素的细菌的计数,1g土样,9ml 无菌水,涂布接种,（二）分解尿素的细菌的计数,（三）设置对照,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。 一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为

5、空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,（三）设置对照,有一位同学在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为268，那么每毫升样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.2毫升）多少？,每毫升样品中的菌落数(C/V) M,C:代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V:代表涂布平板时所用的稀释液的体积 M：稀释的倍数,（二）分解尿素的细菌的计数,三、操作步骤,1、土壤取样,2、样品稀释,3、取样涂布,4、培养与观察,过程：,三、操作步骤,细菌适宜在酸度接近中性的潮湿土壤中生长。,铲去土壤表层目的,从肥沃、湿润的土

6、壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,1、土壤取样,2、样品稀释,三、操作步骤,通常选用一定稀释范围的样品进行培养，以保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板。,3、取样涂布：,按照由104106稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作，每3个一组并分别标号。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。,三、操作步骤,4、微生物的培养与观察：,细菌：30370C的温度下培养12d,放线菌：25280C的温度下培养57d,霉菌：25280C的温度下培养34d,我们可以每隔24h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目,培养温度及时间,观察过程,三、操作步骤,在一定的培养条件下（相同的培养基、温度、及培养时间）同种微生物表现出稳定的相同的菌落特征，不同的微生物菌落特征不同